ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ”א ואינטראקציות בין-מולקולריות.
ביוכימיה חזותית היא טכניקה רבת עוצמה להתבוננות בתכונות הסטוכסטיות של אנזימים בודדים או קומפלקסים של אנזימים המוסתרים בממוצע המתרחש במחקרים בתפזורת. כדי להשיג הדמיה, פינצטות אופטיות כפולות, שבהן מלכודת אחת קבועה והשנייה ניידת, ממוקדות בערוץ אחד של תא מיקרופלואידי מרובה זרמים הממוקם על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הפינצטה האופטית לוכדת מולקולות בודדות של דנ”א מסומן פלואורסצנטי וזרימת נוזלים דרך החדר ומעבר לחרוזים הלכודים, מותחת את הדנ”א לצורת B (תחת כוח מינימלי, כלומר 0 pN) כאשר חומצת הגרעין נצפית כחוט לבן על רקע שחור. מולקולות דנ”א מועברות מזרם אחד למשנהו, על ידי תרגום השלב הניצב לזרימה כדי לאפשר ייזום תגובות באופן מבוקר. כדי להשיג הצלחה, התקנים microfluidic עם ערוצים ברורים אופטית מחוברים מזרקי זכוכית מוחזקים במקום משאבת מזרק. תוצאות אופטימליות משתמשות במחברים המחוברים באופן קבוע לתא הזרימה, צינורות קשיחים מכנית ועמידים כימית, ואשר מחוברים לשסתומי מיתוג המסלקים בועות האוסרות על זרימה למינרית.
היכולת לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ”א ברמת המולקולה הבודדת ובזמן אמת סיפקה תובנה משמעותית לגבי יציבות הגנום 1,2. בנוסף לעבודה עם מולקולות בודדות של דנ”א בזו אחר זו, היכולת להציג עסקאות בין מולקולות בודדות בקרבת מקום מספקת תובנה נוספת 3,4,5. המניפולציה של מולקולות דנ”א נוספות דורשת הן מלכודות אופטיות נוספות והן תאי זרימה מיקרופלואידית איכותיים, רב-ערוציים,6.
קיימות מספר שיטות ליצירת יותר ממלכודת אופטית אחת. אלה כוללים מראות סריקת גלוונומטר, מודולטורים אופטיים אקוסטיים ואופטיקה דיפרקטיבית, המייצרים פינצטה אופטית הולוגרפית 4,7,8,9. לעתים קרובות, מראות סורקות ומודולטורים אופטיים אקוסטיים מייצרים מלכודות המשותפות בזמן. במערך המתואר כאן, הקרן של לייזר Nd:YAG יחיד מפוצלת על קיטוב, ואז מראות סריקת לייזר גלוונומטר שולטות במיקום של מה שמכונה מלכודת ניידת (איור 1)4. כדי להקל על מיקום המראות והמסננים כדי לכוון את קרן הלכידה למפתח הצמצם האחורי של מטרת המיקרוסקופ, נעשה שימוש בלייזר HeNe. זה הופך את היישור הכללי לקל יותר מכיוון שקרן HeNe נראית לעין בלתי, בעוד שקרני אינפרא אדום אינן. קרן HeNe גם בטוחה יותר לעבודה עם הפיכת המיקום של מראות ורכיבים אחרים לפחות מלחיץ. בתחילה, נתיב הקרן עבור לייזר זה נפרד מן הקרן 1064 ננומטר, אבל הוא הציג לתוך אותו נתיב קרן, ולאחר מכן לתוך מטרת המיקרוסקופ. לאחר השגת יישור פיזי, נעשה מיקום קרן 1064 ננומטר על גבי קרן HeNe וזה מתאפשר על ידי שימוש בצופה אינפרא אדום ובכלי הדמיית קרן שונים כדי לדמיין את מיקום הקרן ואיכותה. לאחר מכן, מרחיב הקרן מוצג, וקרן האינפרא אדום המורחבת המתקבלת מיושרת על הפתח האחורי של המטרה. לבסוף, המטרה מוסרת והעוצמה בכל קרן מקוטבת נמדדת ומותאמת באמצעות לוחות גל λ/2 כדי להיות שווים (איור 1C). מדידות הספק נעשות גם לאחר החזרת המטרה ובדרך כלל יש אובדן הספק של 53%. עם זאת, יש מספיק כוח כדי ליצור מלכודות אופטיות קבועות ונעות יציבות במישור המוקד (איור 1D).
כדי לדמות עסקאות דנ”א, תאי זרימה מיקרופלואידיים ממלאים תפקיד מפתח כשהם מאפשרים מדידות מבוקרות ברמת המולקולה הבודדת עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה (איור 2). המונח microfluidic מתייחס ליכולת לתפעל נוזלים בערוץ אחד או יותר עם ממדים הנעים בין 5-500 מיקרומטר10,11. המונח זרם מתייחס לנוזל בפועל בתוך ערוץ והערוץ מתייחס לערוץ הפיזי שבו זרם זורם או זרמים נעים. לתכנון תא זרימה חד-ערוצי יש ערוץ פיזיקלי משותף שבו נצפות תגובות, ובדרך כלל קיים רק זרם נוזל אחד. לפיכך, עיצובים אלה ידועים כתאי זרימה חד-זרמיים. לעומת זאת, תאי זרימה מרובי זרמים מוגדרים כמכשיר מיקרופלואידי שבו שני ערוצי כניסה או יותר מתכנסים לערוץ פיזיקלי יחיד ומשותף (איור 2A). בתוך הערוץ המשותף, הזרמים הזורמים שמקורם בערוצים הבודדים זורמים במקביל זה לזה, ונותרים מופרדים כאשר הערבוב המינימלי ביניהם מתרחש רק כתוצאה מדיפוזיה (איור 2B). ברוב המערכות הניסיוניות, משאבה אחת דוחפת נוזלים לכל ערוץ באותה מהירות. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש בהיגוי גבול, שלוש משאבות או יותר, הנשלטות באופן עצמאי, דוחפות נוזלים דרך התעלות. עם זאת, כל משאבה פועלת במהירות שונה אך קצב הזרימה נטו בערוץ המשותף הואקבוע 12. זה מאפשר החלפה מהירה של רכיבי הערוץ הראשי פשוט על ידי שינוי מהירות המשאבה.
בנוסף לזרימה הלמינרית, גורם קריטי נוסף הוא פרופיל המהירות הפרבולית בתוך זרם הנוזל הלמינרי. מהירות הזרימה הגבוהה ביותר מתרחשת באמצע הנחל, והאיטית ביותר מתרחשת ליד המשטחים (איור 2C)13. יש לשקול פרופיל זה כדי למתוח באופן מלא מולקולת דנ”א המחוברת לחרוז המוחזק בזרם לצורך הדמיה מדויקת של דנ”א פלואורסצנטי וניתוחים מדויקים של מולקולה בודדת. כאן, הדנ”א נמתח לצורת B ומוחזק במקומו תחת 0 pN של כוח. כדי להשיג זאת, המיקוד של מיקום ההשמנה האופטית צריך להיות במיקום של 10-20 מיקרומטר ממשטח הכיסוי התחתון (איור 2D). יש להקפיד על כך שמולקולת הדנ”א לא תימתח מעבר לצורת B, שכן הדבר עלול לעכב תגובות אנזימיות. בתנאי חיץ טיפוסיים, 1 מיקרומטר = 3,000 bp של DNA14. יתר על כן, על ידי לכידת 10-20 מיקרומטר מהכיסוי, קומפלקס הדנ”א ממוקם הרחק מפני השטח ובכך ממזער את האינטראקציות על פני השטח.
שיטות רבות שימשו ליצירת ערוצי התקנים מיקרופלואידיים וניתן לעשות זאת במעבדה או לרכוש תאי זרימה ממקורות מסחריים 6,15,16,17. החומרים האופטימליים המשמשים לבניית תאי הזרימה חייבים להיות קשיחים מכנית, שקופים אופטית עם פלואורסצנטיות נמוכה, ואטומים לממיסים אורגניים6. לעתים קרובות, זכוכית צפה בורוסיליקט, או סיליקה מתמזגת משמשים כדי לספק סביבת זרימה יציבה לזמן ממושך המתאימה להשמנה אופטית, הדמיה וזיהוי כוח. חומרים אלה מאפשרים גם שימוש בממיסים לא מימיים (למשל, מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית) כדי לפשט את ההרטבה וההסרה של בועות אוויר, ודנטורנטים (למשל, 6M guanidinium hydrochloride) או דטרגנטים לניקוי תא הזרימה. לבסוף, השיטות המשמשות להחדרת נוזלים לתאי זרימה משתנות ממערכות משאבות ואקום מורכבות למשאבות מזרק יחיד 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. בגישה המתוארת כאן, נעשה שימוש במשאבת מזרק שיכולה להכיל עד 10 מזרקים (איור 3A). הדבר מספק גמישות לשימוש בתאי זרימה חד-ערוציים או בתאי זרימה עם ערוצי כניסה מרובים. כאן נעשה שימוש בתא זרימה בעל שלושה ערוצים, והוא מחובר למזרקים המוחזקים במקומם על משאבת המזרק באמצעות צינורות פולי-אתר-אתר-קטון (PEEK) (איור 3A-C). זרימת הנוזלים נשלטת על-ידי שסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים, ולכן היא משמשת למזעור החדרת בועות לתא הזרימה (איור 3A,D). בנוסף, מזרקי המילטון בעלי דפנות זכוכית נוקשות ובוכנות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן (PTFE), מומלצים מכיוון שהם מספקים תנועת בוכנה חלקה במיוחד החיונית להשגת זרימה חלקה14,27.
במערכת הניסוי המתוארת נעשה שימוש בתאי זרימה עם שניים עד חמישה ערוצי כניסה. מספר ערוצי הכניסה מוכתב על ידי הניסוי שנעשה. לצורך המחקר של RecBCD ו- Hop2-Mnd1, שני ערוצי זרם היומספיקים 14,28. עבור ההליקאז, האנזים נקשר לקצה החופשי של הדנ”א ותורגם לזרם המכיל מגנזיום ו-ATP כדי ליזום טרנסלוקציה ושחרור. עבור Hop2-Mnd1, דנ”א לכוד אופטית תורגם לזרם הנוזלים הסמוך המכיל חלבונים וחיץ ± יוני מתכת דיוולנטיים. השימוש בתאי זרימה תלת-ערוציים מאפשר ללכוד דנ”א בזרם 1, לתרגם את הדנ”א לזרם 2 כדי לאפשר קשירת חלבונים, ולאחר מכן להזרים 3 היכן ש-ATP נמצא, למשל, כדי ליזום תגובות. וריאציה על האמור לעיל היא להשתמש בחלבון מתויג פלואורסצנטי בערוץ 2, מה שגורם לזרם הנוזלים להיות לבן לחלוטין ומונע הדמיה של הדנ”א. כאשר מולקולה זו מתורגמת לזרם 3, גם חלבונים וגם דנ”א נראים כעת כאשר מתחילות תגובות.
השימוש בשסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים לשליטה בזרימת הנוזלים הוא מרכיב קריטי במערכת לסילוק בועות בתאי הזרימה. בועות מזיקות לזרימת נוזלים יציבה כאשר הן מתכווצות ומתרחבות בדרכים בלתי צפויות וכתוצאה מכך שינויים מהירים במהירות הזרימה והכנסת מערבולות. כאשר השסתומים ממוקמים בין מזרקים וצינורות כניסה, נתיב הזרימה מנותק על ידי החלפת מיקום השסתום כאשר מזרקים מוחלפים. כאשר מזרק חדש הוא הניח במקום, הבוכנה יכולה להיות מדוכאת באופן ידני כך >6 μL נפלט (נפח מת של השסתום) וזה מבטל בועות כמעט לחלוטין.
החיבור של מחברים לתאי זרימה הוא לעתים קרובות השלב המגביל את הקצב בשימוש בתאי זרימה. אנו מתארים את השימוש בשני סוגים של מחברים: נשלפים המכונים התאמה לעיתונות וקבועים (מכללי ננו-פורט). המחברים הנשלפים פשוטים להיצמד לתא זרימה וניתן לבדוק סוגים שונים של צינורות גמישים בנוסף ל- PTFE המומלץ עם מחברים אלה. זוהי דרך מהירה וחסכונית לבדוק צינורות ומחברים מבלי להקריב תאי זרימת זכוכית יקרים יותר. לעומת זאת, מכלולי ננו-פורט מחוברים באופן קבוע, עומדים בלחצים של עד 1,000 psi, ובידינו השימוש בהם מוגבל לצינורות PEEK בקטרים שונים. זה לא חיסרון שכן עדיף להשתמש בצינורות PEEK. תא זרימת זכוכית יחיד עם מכלולים קבועים מחוברים ניתן לעשות שימוש חוזר במשך יותר משנה עם שימוש זהיר.
הרכבה זהירה של מערכת הזרימה היא קריטית לתוצאה המוצלחת של ניסויים 4,6. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הפרוטוקול הוא חיבור המחברים למשטח הזכוכית. לשם כך, אנו משתמשים בשתי הגישות הבאות: מחברי צינורות בהתאמה לעיתונות ומכללי ננו-יציאות. מחברים המתאימים ללחיצה נצמ?…
The authors have nothing to disclose.
המחקר במעבדת ביאנקו נתמך על ידי מענקי NIH GM100156 ו- GM144414 ל- P.R.B.
100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
Stage | Leica | ||
Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |