High-Speed Human Temporal Bone Sectioning voor de beoordeling van COVID-19-geassocieerde middenoorpathologie
Summary
Dit artikel beschrijft een techniek voor snelle menselijke temporale botsectie die een microzaag met dubbele diamantbladen gebruikt om dunne plakjes te genereren voor snelle ontkalking en analyse van temporale botimmunohistochemie.
Abstract
Histopathologische analyse van menselijke temporale botsecties is een fundamentele techniek voor het bestuderen van binnen- en middenoorpathologie. Temporale botsecties worden voorbereid door postmortale temporale botoogst, fixatie, ontkalking, inbedding en kleuring. Vanwege de dichtheid van het temporale bot is ontkalking een tijdrovend en grondstofintensief proces; volledige weefselvoorbereiding kan gemiddeld 9-10 maanden duren. Dit vertraagt otopathologisch onderzoek en belemmert tijdgevoelige studies, zoals die relevant zijn voor de COVID-19-pandemie. Dit artikel beschrijft een techniek voor de snelle voorbereiding en ontkalking van temporale botsecties om de weefselverwerking te versnellen.
Temporale botten werden postmortaal geoogst met behulp van standaardtechnieken en gefixeerd in 10% formaline. Een precisie microzaag met dubbele diamantbladen werd gebruikt om elke sectie in drie dikke secties te snijden. Dikke temporale botsecties werden vervolgens gedurende 7-10 dagen ontkalkt in ontkalkingsoplossing voordat ze werden ingebed in paraffine, gesneden in dunne (10 μm) secties met behulp van een cryotoom en gemonteerd op niet-geladen dia’s. Weefselmonsters werden vervolgens gedeparaffineerd en gerehydrateerd voor antilichaamkleuring (ACE2, TMPRSS2, Furin) en in beeld gebracht. Deze techniek verkortte de tijd van oogst tot weefselanalyse van 9-10 maanden tot 10-14 dagen. Snelle temporele botsectie kan de snelheid van otopathologisch onderzoek verhogen en de middelen verminderen die nodig zijn voor weefselvoorbereiding, terwijl ook tijdgevoelige studies zoals die met betrekking tot COVID-19 worden vergemakkelijkt.
Introduction
Menselijk temporeel botonderzoek biedt een onschatbare bron om de pathologie en pathofysiologie van het binnen- en middenoor te bestuderen. Vóór de 19e eeuw was er weinig bekend over otologische ziekte 1,2,3. Om otologische ziekten beter te begrijpen en “auditieve chirurgie uit de handen van kwakzalvers te redden”, ontwikkelde Joseph Toynbee (1815-1866) methoden om histologische delen van het menselijke temporale bot te bestuderen3. Dit werk werd bevorderd door Adam Politzer (1835-1920) in Wenen en anderen in heel Europa gedurende de rest van de 19e eeuw, die temporale botsecties gebruikte om de histopathologie van veel voorkomende aandoeningen van het oor te beschrijven 2,3,4.
Het eerste laboratorium voor menselijke temporale botten in de Verenigde Staten werd in 1927 geopend in het Johns Hopkins Hospital, waar Stacy Guild (1890-1966) methoden ontwikkelde voor temporale botsectie 5,6. De door Guild ontwikkelde methoden bestonden uit een proces van 9-10 maanden met postmortale oogst, fixatie, ontkalking in salpeterzuur, dehydratie in ethanol, celloidine-inbedding, sectie, kleuring en montage. Wijzigingen in deze techniek werden later aangebracht door Harold Schuknecht (1917-1996)7; de basiscomponenten van dit proces blijven echter in wezen ongewijzigd.
De aanzienlijke middelen die nodig zijn om een laboratorium voor temporale botten te onderhouden, hebben een uitdaging gevormd voor tijdelijk botonderzoek en hebben waarschijnlijk bijgedragen aan de afnemende populariteit ervan in de afgelopen 30 jaar 4,8. Een aanzienlijk deel van de temporale botlaboratoriumbronnen moet worden besteed aan het 9-10 maanden durende proces van temporele botvoorbereiding. Een van de meest tijdrovende stappen in de voorbereiding is de ontkalking van het temporale bot, het dichtste bot in het menselijk lichaam. Ontkalking wordt meestal uitgevoerd in salpeterzuur of ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en duurt weken tot maanden, terwijl de frequente verandering van oplossingenvereist 7,9. Verder kunnen tijdgevoelige studies van het menselijk oor, zoals die met betrekking tot de COVID-19-pandemie, worden belemmerd door dit langzame voorbereidingsproces. Dit artikel beschrijft een techniek voor snelle temporele botsectie die een diamantmicrozaag gebruikt om dikke secties te genereren die snelle ontkalking en weefselanalyse mogelijk maken binnen 10-14 dagen na de tijdelijke botoogst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menselijk temporeel botonderzoek is van cruciaal belang voor het bestuderen van binnen- en middenoorpathologie, maar blijft een tijd- en resource-intensieve onderneming. Dit artikel beschrijft een techniek die een diamantmicrozaag gebruikt om dikke temporale botsecties te genereren die snel kunnen worden ontkalkt voordat ze verder worden gesneden, zodat de tijd van weefseloogst tot studie kan worden teruggebracht van 9-10 maanden tot 10-14 dagen. Deze techniek kan de middelen die nodig zijn voor temporele botverwerking v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Mohamed Lehar voor zijn hulp bij dit project. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
- . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
- Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
