חתך עצמות טמפורליות אנושיות במהירות גבוהה להערכת פתולוגיה של האוזן התיכונה הקשורה ל-COVID-19
Summary
מאמר זה מתאר טכניקה לחתך מהיר של העצם הטמפורלית האנושית המשתמשת במיקרו-מסור עם להבי יהלום תאומים כדי ליצור פרוסות דקות לצורך טשטוש מהיר וניתוח של אימונוהיסטוכימיה של העצם הטמפורלית.
Abstract
ניתוח היסטופתולוגי של נתחי עצם טמפורליים אנושיים הוא טכניקה בסיסית לחקר פתולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה. מקטעי עצם טמפורליים מוכנים על ידי קציר עצם טמפורלית לאחר המוות, קיבוע, דקלסיפיקציה, הטבעה וצביעה. בשל הצפיפות של העצם הטמפורלית, decalcification הוא תהליך גוזל זמן ועתיר משאבים; הכנת רקמות מלאה עשויה להימשך 9-10 חודשים בממוצע. זה מאט את המחקר באוטופתולוגיה ומעכב מחקרים רגישים לזמן, כמו אלה הרלוונטיים למגפת COVID-19. מאמר זה מתאר טכניקה להכנה מהירה של נתחי עצם טמפורליים כדי להאיץ את עיבוד הרקמות.
עצמות טמפורליות נקטפו לאחר המוות בטכניקות סטנדרטיות והתקבעו ב-10% פורמלין. מיקרו-מסור מדויק עם שני להבי יהלום שימש לחיתוך כל מקטע לשלושה חלקים עבים. לאחר מכן, מקטעי עצם טמפורלית עבים הודבקו בתמיסה דקטלסית במשך 7-10 ימים לפני שהוטמעו בפרפין, נחתכו למקטעים דקים (10 מיקרומטר) באמצעות קריוטום, והורכבו על שקופיות לא טעונות. דגימות רקמות הוחרמו לאחר מכן והתייבשו מחדש לצורך צביעת נוגדנים (ACE2, TMPRSS2, Furin) והצטלמו. טכניקה זו הפחיתה את הזמן מהקציר לניתוח רקמות מ 9-10 חודשים ל 10-14 ימים. חיתוך עצם טמפורלית במהירות גבוהה עשוי להגביר את מהירות המחקר באוטופתולוגיה ולהפחית את המשאבים הדרושים להכנת רקמות, תוך הקלה על מחקרים רגישים לזמן כמו אלה הקשורים ל- COVID-19.
Introduction
מחקר העצם הטמפורלית האנושית מספק משאב שלא יסולא בפז לחקר הפתולוגיה והפתופיזיולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה. לפני המאה ה-19, מעט מאוד היה ידוע על מחלה אוטולוגית 1,2,3. כדי להבין טוב יותר את המחלה האוטולוגית ואת “ניתוחי ההצלה האוראליים מידיו של קוואקים”, ג’וזף טוינבי (1815-1866) פיתח שיטות לחקר חלקים היסטולוגיים של העצם הטמפורלית האנושית3. עבודה זו קודמה על ידי אדם פוליצר (1835-1920) בווינה ואחרים ברחבי אירופה במהלך שארית המאה ה -19, שהשתמשו בקטעי עצם טמפורליים כדי לתאר את ההיסטופתולוגיה של מצבים נפוצים רבים המשפיעים על האוזן 2,3,4.
מעבדת העצם הרקתית האנושית הראשונה בארצות הברית נפתחה בשנת 1927 בבית החולים ג’ונס הופקינס, שם פיתחה סטייסי גילד (1890-1966) שיטות לחתך עצמות טמפורליות 5,6. השיטות שפותחו על ידי גילדה כללו תהליך של 9-10 חודשים שכלל קציר לאחר המוות, קיבוע, דקלסיפיקציה בחומצה חנקתית, התייבשות באתנול, הטבעת צלולואידין, חתך, צביעה והרכבה. שינויים בטכניקה זו נעשו מאוחר יותר על ידי הרולד שוקנכט (1917-1996)7; עם זאת, המרכיבים הבסיסיים של תהליך זה נותרו כמעט ללא שינוי.
המשאבים המשמעותיים הנדרשים לתחזוקת מעבדת עצם טמפורלית הציבו אתגר למחקר עצם טמפורלית וככל הנראה תרמו לירידה בפופולריות שלה במהלך 30 השנים האחרונות 4,8. חלק ניכר ממשאבי המעבדה של העצם הרקתית חייבים להיות מוקדשים לתהליך של 9-10 חודשים של הכנת עצם טמפורלית. אחד הצעדים הגוזלים זמן רב ביותר בהכנה הוא decalcification של העצם הטמפורלית, שהיא העצם הצפופה ביותר בגוף האדם. דקלקציה מבוצעת בדרך כלל בחומצה חנקתית או בחומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) ונמשכת שבועות עד חודשים תוך דרישה לשינוי תכוף של תמיסות 7,9. יתר על כן, מחקרים רגישים לזמן של האוזן האנושית, כמו אלה הקשורים למגפת COVID-19, עשויים להיות מעוכבים על ידי תהליך ההכנה האיטי הזה. מאמר זה מתאר טכניקה לחתך עצם טמפורלית במהירות גבוהה המשתמשת במיקרו-מסור יהלום כדי ליצור חתכים עבים המאפשרים טשטוש מהיר וניתוח רקמות תוך 10-14 יום מקצירת עצם טמפורלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר עצמות טמפורליות אנושיות הוא קריטי לחקר הפתולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה, אך הוא נותר מאמץ עתיר זמן ומשאבים. מאמר זה מתאר טכניקה המשתמשת במיקרו-מסור יהלום כדי ליצור מקטעי עצם טמפורליים עבים שניתן לנטרל במהירות לפני חתך נוסף, כך שניתן יהיה להפחית את הזמן מקצירת הרקמות למחקר מ-9-10 חוד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למוחמד להאר על עזרתו בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
- . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
- Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
