原子間力顕微鏡と偏光顕微鏡を組み合わせた肝臓のこわばり測定

すべての動物実験は、分子遺伝学研究所の動物管理委員会によって承認された動物プロトコルおよび動物実験に関するEU指令2010/63 / EUに従って実施されました。提示されたプロトコルの全体概略図を 図1に示します。 図1:マウス肝臓からのヤング率のAFM評価の全体概略図。 (A)対照マウスまたは処置マウスからの肝臓の単離、それに続く切片作成および−80°Cでの貯蔵(最大保存、2週間)。(B)球状ビーズをカンチレバーに取り付け、その後接着剤を一晩硬化させる(左)。カンチレバーキャリブレーションとそれに続くサンプルマウント(右)。(C)明るいコラーゲン構造を視覚化するための偏光子と分析器の位置合わせに続いて、AFMカンチレバーの下の測定フィールドとカメラ内の画像のオーバーレイ。(D)剛性マップの取得と解析。略語:AFM =原子間力顕微鏡;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;OCT = 最適な切削温度コンパウンド;CCl4 =四塩化炭素。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1. サンプル調製 I 麻酔下で頸部脱臼によって安楽死させたマウスの開いた腹部から肝臓を切除する。左外側ローブを分離し、ドライアイスで急速凍結することにより、ローブの外側半分を最適な切断温度(OCT)コンパウンドに埋め込みます。OCT包埋組織は-80°Cで保存してください。注:以前の研究では、凍結組織と新鮮組織の間で剛性値が類似していることが示されています25,26。 厚さ30 μmの肝臓切片をクライオトームを使用して正に帯電したスライドに切断し、AFM測定の日までスライドを-80°Cで2週間以内に保管します。 2.機器のセットアップ AFMカンチレバーチップへの5.7 μmビーズの取り付け(補足図S1、ステップ1〜5)注:カンチレバーへのビーズの取り付けは、Norman et al.46によって以前にも説明されています。直径5.7 μmのメラミン樹脂ビーズの懸濁液をスライドガラスの半分の領域に均等に広げ、風乾して溶媒を蒸発させます(補足図S1、ステップ1)。 スライドの残りの半分に、10 μLのチップを使用して、作業時間の長いプレミックスエポキシ樹脂の細い線を作成します(補足図S1、ステップ1)。 製造元の指示に従って、カンチレバープローブをAFMヘッドにロードします。 カンチレバープローブを取り付けたAFMヘッドでスライドとカバーを取り付けます。注:SD-qp-BioT-TL-10カンチレバーが研究に使用されました。 プレミックスされたエポキシ樹脂接着剤をスライドの中央に持ってきて、低力でカンチレバーで接着剤に近づきます(このプロトコルに従うには、設定値を1 Vに設定します。補足図S1、ステップ2)。注意: スライド面に近づく前に、セクション6、パート8、AFMカンチレバーのスプリング定数のキャリブレーションの手順2〜3に従って、レーザーがカンチレバーの先端の中央に位置合わせされていることを確認してください。 カンチレバープローブの先端が接着剤と接触したら、スライドのすぐ上に移動して余分な接着剤を取り除きます。 次に、カンチレバーの先端をスライドから引っ込め、スライドを動かして、中央に1つのビーズを移動します(補足図S1、ステップ3)。より高い力(設定値2 V)でAFMカンチレバープローブを使用してビードに再度近づき、カンチレバープローブの中央にビーズを取り付け、少なくとも10秒間放置します(補足図S1、ステップ4)。 カンチレバープローブを取り出し、室温で一晩保管して接着剤を硬化させるか、エポキシ樹脂の指示に従ってください(補足図S1、ステップ5)。 偏光子とアナライザーのセットアップ肝臓切片内の関心領域を見つけるには、偏光子と分析装置を備えた顕微鏡をセットアップします。一方を他方に対して手動または自動化された方法で回転させることにより、振動方位角を互いに0°〜90°の角度に合わせ、透過光を最小限に抑え、対物レンズを通過する異常な光線を最大化します。偏光画像(図2)の暗い背景に対してコラーゲン線維が明るく見えることを確認し、画像ヒストグラムのピークが明るいピクセルにシフトすることによって反映されます。 図2:代表的な顕微鏡画像は、明視野画像と比較して、偏光顕微鏡におけるコラーゲン線維の顕著な視覚化を示しています。CCl4で3週間処置したマウスからの肝臓切片を、(A)明視野および(B)偏光顕微鏡に供した。複屈折コラーゲン線維は、明視野画像と比較して偏光画像で白くはっきりと見えます。赤いボックスは、AFM測定に使用されるコラーゲンが豊富な領域を表します。差し込み図は、赤いボックスにエリアの拡大ビューを表示します。スケールバー= 100μm。略語:AFM =原子間力顕微鏡;CCl4 =四塩化炭素;CV =中心静脈;PV =門脈。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 注:このプロトコルでは、AFMヘッドを任意の適切な倒立顕微鏡に取り付けることができ、偏光子と分析装置を挿入することができます。システムは、バックグラウンドノイズを低減するために絶縁ユニットに配置する必要があります。 AFMカンチレバーのばね定数の校正製造元の指示に従って、カンチレバープローブ(セクション1、パート2、AFMカンチレバーチップへの5.7μmビーズの取り付けの手順1〜8に従って準備)をAFMヘッドにロードします。 測定中のカンチレバーの汚染を防ぐために、70%エタノールでカンチレバーを清掃してください。蒸留水で広範囲に洗浄して、チップから残留エタノールを取り除きます。 接触モードを有効にし、測定方法としてフォースマッピングを選択します。 対応するボタンをクリックして、ソフトウェアタブで関連するすべてのウィンドウ(Zステッピングモーター、電動ステージコントロール、データビューア、フォーススキャンマップオシロスコープ、レーザーアライメント、カメラウィンドウ)を開きます。 1.2 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む清潔なスライドガラスを、疎水性マーカーペンで描かれた約2 cm x 4 cmの領域に取り付けます。AFMヘッドを顕微鏡ステージに取り付け、カンチレバーがPBSに完全に浸されていることを確認します。 カンチレバーの先端に対物レンズを集中させます。顕微鏡の透過光の強度を下げて、モニター上のレーザー位置をよりよく表示します。 レーザーをカンチレバーの半透明の端(球状ビーズが取り付けられている端)に向け、AFMヘッドのノブを使用してミラーの位置を合わせ、検出器のレーザービームの合計強度を最大化します( レーザーアライメント ウィンドウの合計で示されます)。 AFMヘッドにあるノブを使用してフォトダイオード検出器の位置を合わせ、レーザーをその中心に配置します。 キャリブレーションを続行する前に、カンチレバーを15分間安定させます。 キャリブレーションマネージャを開き、カンチレバーのタイプ、カンチレバー寸法、環境条件を挿入します。[キャリブレーション]をクリックして、スプリング定数と感度(逆光学レバー感度、InvOLSとも呼ばれます)をキャリブレーションします。校正後に得られたばね定数の精度をメーカー宣言で確認してください。非接触モードでカンチレバーを校正します(校正は、Saderらによって導出された熱定理を使用してソフトウェアによって実行されます58)。注:カンチレバーのバネ定数は、カンチレバーの剛性を表し、変形長さごとに変形するカンチレバーの抵抗力によってN / mで与えられます。カンチレバーの感度は、カンチレバーのたわみ(ナノメートル単位)に応じたフォトダイオード応答の値(ボルト単位)を表し、通常はnm/V59で表されます。非接触モードでは、熱ノイズスペクトルが記録され、校正後にAFM制御ソフトウェアによって流体力学的機能60 が自動的に取り付けられます。継ぎ手は、キャリブレーションパラメータ、つまりばね定数とInvOLSを提供します。この研究で使用したSD-qp-BioT-TL-10カンチレバーのバネ定数は、メーカーが宣言したように0.09 N / mでした。 3. サンプル調製 II 凍結切片(セクション1、サンプル調製Iに記載されているように-80°Cで保存)を室温で2分間解凍します。 氷冷した4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1x PBSで4°Cで10分間固定した後、1x PBSで広範囲に洗浄(5x)します。切片の周りの残留PBSをティッシュで拭き取り、疎水性マーカーペンで肝臓切片の周囲約2 cm x 4 cmの境界に印を付けます。サンプルを1x PBSで覆います(境界領域に1x PBSが~1.2 mL含まれていることを確認してください)。AFM測定にはサンプルを使用してください。注意: PFAは危険な化学物質であるため、皮膚や目との接触を防ぐために注意して取り扱う必要があります。有毒ガスを避けるために、PFAを含むすべての手順は、認定された化学ヒュームフードまたはその他の承認された換気エリアで実行する必要があります。 4. 測定 自動保存を有効にするには、[セットアップ]タブに移動し、[自動保存]にチェックマークを付けます。測定ファイルを保存するファイル名とディレクトリを指定するには、[設定]タブに移動し、[設定の保存]をクリックします。 サンプルをロードします(セクション3、サンプル調製IIに従って調製)。 レーザー をオンにしてアプローチキーをクリックして、AFMカンチレバーで組織表面に アプローチ します。先端が組織表面に接触したら、先端が対物レンズの焦点に留まるように片持ち梁の先端を引っ込めます( リトラクション キーをクリックすると、カンチレバーがピエゾ範囲の上端に引っ込められます)。レーザー位置が レーザーアライメント ウィンドウの中心から離れている場合は、検出器を再調整します。 レーザーをオフにし、顕微鏡の光学場をAFM測定マップにオーバーレイするには、[アクセサリ]タブをクリックし、[直接オーバーレイ光学キャリブレーション]を選択します。次のウィンドウで、[次へ]をクリックして、特定の領域をスキャンするカンチレバーの一連の画像を撮ります。もう一度[次へ]をクリックして、次のウィンドウに進みます。 最初の画像では、カンチレバーの先端の中央を手動でクリックして、ソフトウェアで先端の位置を示しています。先端位置を表す円は、精度 を高めるために半径を示す ことでサイズを操作できます。[ キャリブレーション]をクリックすると、すべての画像で片持ち梁の先端位置が自動的に検出されます。画像を見て、チップ検出の精度を確認します。 [ 次へ ]、[ 完了] の順にクリックして光学オーバーレイを終了し、光学キャリブレーション中にキャプチャされた一連の画像を保存します。 カンチレバーをさらに引っ込めて、スライド上のより高い表面との衝突を回避します。ステージを移動し、偏光画像を使用して[データビューア]タブに表示されている緑色のボックス内にコラーゲンが豊富な領域を配置します。コラーゲンが豊富な領域を選択し、指定した緑色のボックス内でマウスの左ボタンを長押しして、その周りに長方形を作成します。左側の[グリッド]タブで選択した領域の寸法、方向、解像度を定義します。[新しいスキャン領域の確認]をクリックして、選択した領域を測定領域として設定します。 フィードバックループのIGainおよびPGainパラメータをデフォルト値に保ちます(システムの過敏性の形で大きな不安定性が現れない場合)。このプロトコルに従うには、IGain を 50 Hz、PGain を 0.001 に設定します。 セットポイントを1nNに設定します。注意: 設定値は、静止状態の間の先端と表面の相互作用の力です。ほとんどのソフトサンプル(細胞、ゲル、組織)では、0.5〜2.0 nNの範囲のセットポイント値が適切です。 調査対象の材料の機械的特性とカンチレバーの剛性に応じて、 相対設定値 を選択します。このプロトコルでは、値を 5 nN に設定します。注意: 相対設定値は、力-距離曲線のピークに達し、先端の動きがベースラインに戻ったときの相互作用の最大力を表します。柔らかい材料(1〜50 kPa)の場合、このパラメーターはナノニュートン(nN)単位で設定されます。さらに、柔らかいカンチレバー(ばね定数が0.05 N / mから0.35 N / m)の場合、適用できる最大力は約50 nNです。 それに応じて 、セットポイント値と 相対セットポイント値 を調整します。与えられた設定値が球面圧子の半径よりも大きな押し込み深さにならないことを確認してください、さもなければインデント面はヤング率の計算で適切に定義できません。インデントの最初の実行後のインデント深さの平均値を計算します。記録されたデータの処理方法については、セクション5「データ分析」を参照してください。必要に応じて 設定値 を調整します。 [ベースラインの調整] を 5 に設定します。注:ここで、 ベースライン とは、アプローチ曲線とリトラクト曲線をフィッティングするために使用される多項式の次数を指します。ベースラインを5に設定すると、曲線が高解像度にフィットするため、測定中のバックグラウンドノイズを確実にキャプチャできます。 サンプルの表面トポグラフィーに応じて、Z軸のカンチレバー移動の長さ(Z長さ)を選択します。このプロトコルに従うには、 Z長 を 15μmに設定します。注:高い値( 15μmなど)は測定感度を低下させますが、通常、線維性肝臓組織などの非常に不規則な表面を持つサンプルに必要です。 [Z 移動] を [一定時間] に設定します。注意: Z 移動を 一定 速度に設定して、 Z移動 (速度の 延長と 時間の延長)を参照するデータを別のモードで表示することもできます。 [延長時間] を 1 秒に設定します。延長遅延とリトラクション遅延を0に設定します。注意: 非常に柔らかい材料61には、>5.0 μm / sの延長速度を使用してください。押し込み速度が低いと、柔らかい表面からの粘性が高く、弾性応答が低下するためです。 伸長 遅延および収縮遅延 は、カンチレバーチップと基板との間の特定の相互作用(例えば、カンチレバーの表面に固定化されたタンパク質とスライド表面に固定化されたタンパク質との相互作用)を研究するために使用できるパラメータです。 サンプルレートを5000Hzに設定します。注: サンプルレートは、完全なアプローチリトラクト曲線に記録されたポイントの頻度を指します。これを高い値( 5000 Hzなど)に設定して、非常に速い遷移のために曲線の特定の領域が欠落しないようにします。 Zクローズドループをティックでマークしてフィードバックループシステムを有効にし、サンプル表面とカンチレバーチップの間の連続距離を確保します。 「エンゲージ」の選択を解除して電動ステージを解除し、「アプローチ」をクリックしてカンチレバーでサンプルに近づきます。[スキャンの開始]をクリックして、手順6で設定した領域で力と距離の曲線の収集を開始します。セクション4、測定。 5.データ分析 取得したデータをオープンソースソフトウェア「AtomicJ」(https://sourceforge.net/projects/jrobust/ からダウンロード可能)で解析します。注:アジレントテクノロジー、JPKインスツルメンツ、またはブルカー原子間力顕微鏡から収集されたファイルをサポートしています。 AtomicJのプロセス力曲線とマップアイコンをクリックして、 力曲線 をプログラムにロードします(補足図S2A、x)。 処理アシスタントで、[ 追加 ]ボタンをクリックして分析するマップを追加します(補足図S2A、y)。マップが読み込まれたら、[ 次へ ]をクリックします(補足図S2A、z)。 次のウィンドウで、以下に説明する手順( 補足図S2B、手順1〜11のステップに対応)に従って処理設定を指定します。サンプルとカンチレバーの接触点を、計算によって手動で推定するか、フィッティング曲線パラメータのセットを使用して自動的に推定します。このプロトコルに従うには、接点 の自動 推定を使用します。 カンチレバーとサンプルの 接触点 を 、クラシックフォーカスグリッド法で決定します。 データ分析の最適化中に経験的に決定する必要がある測定された力曲線の品質に基づいて接触点の最良の決定をもたらす 推定方法 を選択します。このプロトコルに従うには、 モデルに依存しない方法を使用します。 クラシックモデルを使用して力のくぼみ曲線をフィットします(このプロトコルに従うには、モデルのフィットにクラシックL2を使用します)。注: モデル 適合と接触 推定器 は、それぞれソフトウェアによる曲線の適合方法と適合曲線での接触点の確立方法を制御するパラメータです。これらの測定には、最小二乗回帰を使用する クラシック オプションが使用されました。これにより、曲線上の各低力点が試行接触点として処理され、試行接触点の前の領域に多項式が適合します。次に、適切な接触モデルを、収集された力のくぼみデータに適合させます。最小平方和を与える点が接触点と見なされます。得られた力曲線の質に基づいて他の方法を使用することができる62、63。 モデルの フィット を 撤回 曲線に設定します。 ポアソン比を0.45に設定します(肝臓24などの軟部組織に推奨)。 ベースライン角度 3 と接触角度 1 を使用して曲線のフィットを設定します。モデルからの曲線の偏差のスケールに基づいて多項式適合度を変更します。 引き出し曲線のフィットに使用するモデルを選択します。式 (1) と式 (2) に基づいてヤング率を計算するスネドン モデルを使用します。(1)δ = (2)ここで、Fは力、Eはヤング率、vはサンプルのポアソン比、δはくぼみの深さ、aは接触半径、Rは球半径62,63です。 球形の先端の 半径 をマイクロメートル単位で記入します(このプロトコルでは2.9μm )。 読み込みを有効にして、データ ファイルから Spring 定数と InvOLS を読み込みます (チェック ボックスをオンにします)。 [ 完了]をクリックします。注:解析されたデータは、各力曲線について計算された垂直方向のたわみ、高さ、接着力、接触力、変形、接着力、R2 値、傾き、ヤング率、遷移押し込み、遷移力、および接触位置のマップ形式で表示されます(補足図S3、左上)。2つの追加のウィンドウには、力曲線と生の値が表示されます(補足図S3、それぞれ右上と下のパネル)。 カンチレバーが肝臓セクションの表面に誤って接近した力曲線を除外します。これらを特定するには、 図3 で示され、他の場所で詳細に説明されているように、高ノイズ、異常な形状、および/または不完全なアプローチを持つ曲線を探します46。 図3:代表的な力-変位曲線の例。 (A,B) より硬い(A;E = 10.5 kPa)で柔らかく(B;E = 1.78 kPa)解析に適した領域。(C-F)(C-E)誤ったアプローチまたは(F)より高いノイズのために分析から除外する必要がある代表的な解釈不可能なグラフ。(A)の凡例に示されているように、赤い曲線はカンチレバーの接近を示し、緑の曲線はカンチレバーの後退を示します。黒い線は、カンチレバーの引き出し曲線のフィッティングを示しています。黒い線の傾きはヤング率に対応しています。赤と青の点は、それぞれ接触点と遷移点に対応しています。接触点は、収縮中のカンチレバーと基板の間の最後の接触点であり、遷移点は、カンチレバーのアプローチから収縮への遷移を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。