JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Meting van leverstijfheid met behulp van atomic force microscopie in combinatie met polarisatiemicroscopie

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/63974
, , , , ,
1Laboratory of Integrative Biology,Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2CEITEC MU,Masaryk University, 3Department of Biochemistry, Faculty of Science,Masaryk University, 4Laboratory of Biomathematics,Czech-BioImaging IPHYS, Institute of Physiology of the Czech Academy of Sciences

Summary

We presenteren een protocol om de elastische moduli van collageenrijke gebieden in normale en zieke lever te meten met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Het gelijktijdige gebruik van polarisatiemicroscopie biedt een hoge ruimtelijke precisie voor het lokaliseren van collageenrijke gebieden in de leversecties.

Abstract

Matrixversteviging is erkend als een van de belangrijkste oorzaken van de progressie van leverfibrose. Het heeft diepgaande effecten op verschillende aspecten van celgedrag, zoals celfunctie, differentiatie en beweeglijkheid. Omdat deze processen echter niet homogeen zijn in het hele orgaan, is het steeds belangrijker geworden om veranderingen in de mechanische eigenschappen van weefsels op cellulair niveau te begrijpen.

Om de verstijving van collageenrijke gebieden in de leverkwabben te kunnen volgen, presenteert dit artikel een protocol voor het meten van leverweefselelastische moduli met hoge ruimtelijke precisie door atoomkrachtmicroscopie (AFM). AFM is een gevoelige methode met het potentieel om lokale mechanische eigenschappen te karakteriseren, berekend als Young’s (ook wel elastische) modulus genoemd. AFM in combinatie met polarisatiemicroscopie kan worden gebruikt om specifiek de gebieden van fibrose-ontwikkeling te lokaliseren op basis van de birefringence van collageenvezels in weefsels. Met behulp van het gepresenteerde protocol hebben we de stijfheid van collageenrijke gebieden van fibrotische muizenlevers en overeenkomstige gebieden in de levers van controlemuizen gekarakteriseerd.

Een prominente toename van de stijfheid van collageenpositieve gebieden werd waargenomen bij de ontwikkeling van fibrose. Het gepresenteerde protocol maakt een zeer reproduceerbare methode van AFM-meting mogelijk, vanwege het gebruik van mild vast leverweefsel, dat kan worden gebruikt om het begrip van door ziekte geïnitieerde veranderingen in lokale weefselmechanische eigenschappen en hun effect op het lot van naburige cellen te bevorderen.

Introduction

De lever is een vitaal orgaan voor het handhaven van homeostase in organismen 1,2. Chronische leverziekten zijn goed voor ~ 2 miljoen sterfgevallen wereldwijd per jaar3. Ze ontstaan meestal als virale infecties, auto-immuunziekten, metabool syndroom of aan alcoholmisbruik gerelateerde ziekten en gaan gepaard met progressieve leverfibrose. Leverbeschadiging lokt een ontstekingsreactie uit, wat leidt tot de activering van cellen die extracellulaire matrix (ECM) afzetten in een wondgenezende reactie. In de aanwezigheid van een chronische belediging vormt overtollige ECM echter onopgelost littekenweefsel in de lever, wat leidt tot de ontwikkeling van leverfibrose, cirrose, levercarcinoom en uiteindelijk tot leverfalen4.

Hepatocytenletsel resulteert onmiddellijk in verhoogde leverstijfheid 5,6. Dit heeft direct invloed op de hepatocytenfunctie, activeert hepatische stellaatcellen (HSC’s) en portale fibroblasten en resulteert in hun transdifferentiatie naar collageen-afzettende myofibroblasten 7,8. De afzetting van vezelige ECM verhoogt de leverstijfheid verder, waardoor een zelfversterkende feedbacklus van leververstijving en matrixproducerende celactivering ontstaat.

Leverstijfheid is dus een belangrijke parameter geworden in de prognose van leverziekten. De verandering in biomechanische weefseleigenschappen kan eerder worden gedetecteerd dan fibrose kan worden gediagnosticeerd door histologische analyse. Daarom zijn er verschillende technieken voor leverstijfheidsmeting ontwikkeld in zowel onderzoek als klinische toepassingen. In klinische settings zijn transiënte elastografie (TE)9,10,11,12,13 en magnetische resonantie-elastografie (MRE)14,15,16,17,18 gebruikt om niet-invasief vroege stadia van leverschade te diagnosticeren door grove leverstijfheid te onderzoeken 19.

In TE worden ultrasone golven van milde amplitude en lage frequentie (50 Hz) door de lever verspreid en wordt hun snelheid gemeten, die vervolgens wordt gebruikt om weefselelastische modulus13 te berekenen. Deze techniek is echter niet nuttig voor patiënten met ascites, obesitas of lagere intercostale ruimtes als gevolg van onjuiste overdracht van de ultrasone golven door de weefsels rond de lever9.

MRE is gebaseerd op magnetische resonantie beeldvormingsmodaliteit en maakt gebruik van 20-200 Hz mechanische schuifgolven om zich op de lever te richten. Een specifieke magnetische resonantie beeldvormingssequentie wordt vervolgens gebruikt om de golven in het weefsel te traceren en de weefselstijfheid te berekenen16. Stijfheidswaarden gerapporteerd met zowel TE- als MRE-technieken correleren goed met de mate van leverfibrose verkregen uit biopsieën van menselijke levermonsters gerangschikt met behulp van histologische METAVIR-scores20 (tabel 1). TE en MRE zijn ook aangepast voor het meten van leverstijfheid in knaagdiermodellen voor onderzoeksdoeleinden 21,22,23. Aangezien beide methoden echter de stijfheidswaarden afleiden uit de reactie van het weefsel op de zich voortplantende schuifgolven, weerspiegelen de verkregen waarden mogelijk niet de absolute mechanische stijfheid van het weefsel.

Voor een directe mechanische karakterisering van knaagdierlevers ontwikkelden Barnes et al. een model-gel-weefseltest (MGT-assay) waarbij leverweefsel wordt ingebed in polyacrylamidegel24. Deze gel wordt samengeperst door een gepulseerde uniforme kracht waaruit young’s modulus kan worden berekend. De MGT-test toont een goede correlatie met een indentatietest die is aangepast voor zowel normale als fibrotische levers24 (tabel 1).

Tabel 1: Leverstijfheidswaarden op bulkniveau. TE en MRE vergeleken met directe ex vivo mechanische metingen van leverelastische moduli met behulp van inkepingen en MGT-assays voor levers uit verschillende bronnen. De relatie tussen E en G wordt gegeven door E = 2G (1 + v), waarbij v de Poisson-verhouding van het monster is; F0 tot F4 vertegenwoordigen de fibrosescore in het METAVIR-scoresysteem, waarbij F0 lage of geen fibrose en F4-cirrotische levers aanduidt. Afkortingen: TE = transiënte elastografie; MRE = magnetische resonantie-elastografie; MGT = model-gel-weefsel; E = elastische (Young’s) modulus; G = afschuifmodulus. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Een van de belangrijkste nadelen van generieke leverstijfheidsmetingen is dat ze geen resolutie op cellulair niveau van stijfheid heterogeniteit in de lever bieden. Tijdens de progressie van fibrose vertonen collageenrijke gebieden een hogere stijfheid in vergelijking met het omringende parenchym25,26. Deze stijfheidsgradiënt beïnvloedt lokaal de residente cellen en speelt een belangrijke rol bij het aansturen van HSC-heterogeniteit27. Veranderingen in lokale mechanische eigenschappen tijdens de ontwikkeling van leverziekten moeten dus op microscopisch niveau worden gekarakteriseerd om de progressie van fibrose beter te begrijpen.

AFM maakt het mogelijk om de mechanische eigenschappen van weefsel te meten met een hoge resolutie en hoge krachtgevoeligheid. AFM gebruikt de punt van een cantilever om het oppervlak van een monster in te laten inspringen met krachten zo laag als verschillende piconewtons, waardoor een vervorming op microscopisch of nanoscopisch niveau wordt geïnduceerd op basis van de geometrie en grootte van de gebruikte tip. De krachtrespons van het monster op de toegepaste stam wordt vervolgens gemeten als de doorbuiging in de cantilever28. Krachtverplaatsingscurven worden verzameld uit de nadering en terugtrekking van de cantilever, die kan worden uitgerust met geschikte contactmechanicamodellen om de lokale stijfheid van het monster te evalueren29.

Naast het meten van de stijfheid van een bepaald gebied, kan AFM ook topografische informatie geven over specifieke kenmerken in het monster, zoals de structuur van collageenvezels 30,31,32. Meerdere studies hebben de toepassing van AFM beschreven om de stijfheid van verschillende gezonde en zieke weefsels te meten, zoals huid 32,33, long34,35, hersenen36, borst 37,38,39, kraakbeen 40 of hart 41,42,43,44 uit zowel patiënt- als muismodelmonsters. Verder is AFM ook in vitro gebruikt om de stijfheid van cellen en extracellulaire eiwitsteigers te bepalen 45,46,47.

De meting van de mechanische eigenschappen van biologische monsters met AFM is niet triviaal vanwege hun zachtheid en kwetsbaarheid. Verschillende studies hebben dus verschillende omstandigheden en instellingen gestandaardiseerd, die sterk fluctuerende waarden van Young’s moduli opleveren (beoordeeld door Mckee et al.48). Net als andere zachte weefsels vertonen de moduluswaarden van lever Young bij verschillende gradaties leverfibrose ook uitgebreide variatie (tabel 2). De verschillen in de moduluswaarden van Young komen voort uit verschillen in de werkingswijze van de AFM, de uitkragingstip, de monstervoorbereidingsmethode, de dikte van het monster, de inkepingsdiepte en -krachten, de omgeving van leverweefsel tijdens de meting en de analysemethode (tabel 2).

Tabel 2: Leverstijfheidswaarden op cellulair niveau. Leverstijfheidswaarden verkregen met behulp van AFM beschrijven de mechanische eigenschappen van de lever op cellulair niveau. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; E = elastische (Young’s) modulus; PFA = paraformaldehyde; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Dit artikel beschrijft een protocol voor de reproduceerbare meting van Young’s moduli van collageenrijke fibrotische gebieden in leverweefsel door AFM met een nauwkeurige lokalisatie door het gebruik van polarisatiemicroscopie. We dienden koolstoftetrachloride (CCl4) toe om collageenafzetting op een centrilobulaire manier te induceren49 in een muismodel, waarbij op betrouwbare wijze cruciale aspecten van menselijke leverfibrose werden nagebootst50. Gepolariseerde microscopische beelden maken de visualisatie van collageen in de lever mogelijk vanwege de birefringence van collageenvezels51, die een nauwkeurige positionering van de cantilevertip over het gewenste interessegebied binnen de leverlob mogelijk maakt52.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met een dierprotocol dat is goedgekeurd door het Animal Care Committee van het Institute of Molecular Genetics en volgens de EU-richtlijn 2010/63/EU voor dierproeven. Een algemeen schematisch diagram van het gepresenteerde protocol is weergegeven in figuur 1. Figuur 1: Algemeen schema van afm-evaluatie van Young’s modulus uit muizenlevers. (A) Isolatie van lever van controle of behandelde muizen gevolgd door sectie en opslag bij −80 °C (maximale opslag, 2 weken). (B) Bevestiging van de bolvormige kraal aan de cantilever met daaropvolgende uitharding van lijm ‘s nachts (links). Cantilever kalibratie gevolgd door monstermontage (rechts). (C) Uitlijning van de polarisator en analysator om heldere collageenstructuren te visualiseren, gevolgd door een overlay van het beeld in de camera met het meetveld onder de AFM-cantilever. (D) Verwerving van stijfheidskaarten en -analyse. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; OCT = optimale snijtemperatuurverbinding; CCl4 = tetrachloorkoolstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 1. Monstervoorbereiding I Snijd de lever uit de geopende buik van een muis die wordt geëuthanaseerd door cervicale dislocatie onder anesthesie. Isoleer de linker laterale kwab en integreer de laterale helft van de kwab in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding door snel in te vriezen op droogijs. Bewaar het OCT-ingebedde weefsel bij −80 °C.OPMERKING: Eerdere studies hebben aangetoond dat de stijfheidswaarden vergelijkbaar zijn tussen bevroren en verse weefsels25,26. Sectie 30 μm dikke leversecties op positief geladen dia’s met behulp van een cryotoom en bewaar de dia’s bij −80 °C tot de dag van afm-meting niet meer dan 2 weken later. 2. Het instrument instellen Bevestiging van een kraal van 5,7 μm aan de AFM-cantileverpunt (aanvullende figuur S1, stappen 1-5)OPMERKING: De bevestiging van de kraal aan de cantilever werd ook eerder beschreven door Norman et al.46.Verdeel de suspensie van melamineharsparels met een diameter van 5,7 μm gelijkmatig over de helft van het oppervlak van een glasschuif en droog aan de lucht om het oplosmiddel te verdampen (aanvullende figuur S1, stap 1). Maak op de andere helft van de dia met een punt van 10 μL een dunne lijn van voorgemengde epoxyhars met een lange werktijd (aanvullende figuur S1, stap 1). Laad de sledesonde op de AFM-kop volgens de instructies van de fabrikant. Monteer de schuif en het deksel met de AFM-kop die is uitgerust met de sledesonde.OPMERKING: In het onderzoek werd een SD-qp-BioT-TL-10 cantilever gebruikt. Breng de voorgemengde epoxyharslijm naar het midden van de dia en benader de lijm met de cantilever met een lage kracht (stel een instelpunt in op 1 V om dit protocol te volgen; Aanvullende figuur S1, stap 2).OPMERKING: Voordat u het schuifoppervlak nadert, moet u ervoor zorgen dat de laser is uitgelijnd in het midden van de vrijdragende punt, aangegeven door een hoge somspanning door stappen 6-8 in sectie 2, deel 3, Kalibratie van de veerconstante van de AFM-cantilever te volgen. Nadat de punt van de cantileversonde contact maakt met de lijm, verplaatst u deze net boven de glijbaan om overtollige lijm te verwijderen. Trek nu de uitkragingspunt van de dia in en verplaats de dia om een enkele kraal in het midden te brengen (aanvullende figuur S1, stap 3). Benader de kraal opnieuw met de AFM-sledesonde met een hogere kracht (instelpunt 2 V) om de kraal in het midden van de sledesonde te bevestigen en ten minste 10 s te laten staan (aanvullende figuur S1, stap 4). Pak de sledesonde uit en houd deze een nacht op kamertemperatuur om de lijm uit te harden of volg de instructies voor de epoxyhars (aanvullende figuur S1, stap 5). De polarisator en analyzer instellenOm de interessegebieden in de leversecties te lokaliseren, stelt u de microscoop in met de polarisator en analysator. Lijn hun trillingsazimuten uit onder een hoek tussen 0° en 90° ten opzichte van elkaar door een van hen handmatig of op een geautomatiseerde manier ten opzichte van de andere te draaien om het doorgelaten licht te minimaliseren en buitengewone stralen die door het doel gaan te maximaliseren. Zorg ervoor dat de collageenvezels helder lijken tegen een donkere achtergrond in de gepolariseerde afbeelding (figuur 2), die wordt weerspiegeld door een verschuiving in de piek van het histogram van de afbeelding naar heldere pixels. Figuur 2: Representatieve microscopiebeelden tonen een uitgesproken visualisatie van collageenvezels in gepolariseerde microscopie in vergelijking met brightfield-beelden. Leversecties van muizen die gedurende 3 weken met CCl4 werden behandeld, werden onderworpen aan (A) brightfield en (B) gepolariseerde microscopie. Birefringente collageenvezels zijn duidelijk zichtbaar in wit in gepolariseerde afbeeldingen in vergelijking met brightfield-afbeeldingen. Het rode vak vertegenwoordigt collageenrijk gebied dat wordt gebruikt voor de AFM-meting. Inzetstukken tonen ingezoomde weergaven van het gebied in het rode vak. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; CCl4 = tetrachloorkoolstof; CV = centrale ader; PV = poortader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. OPMERKING: Voor dit protocol kan de AFM-kop op elke geschikte omgekeerde microscoop worden geïnstalleerd met de mogelijkheid om een polarisator en een analysator in te brengen. Het systeem moet in een isolatie-eenheid worden geplaatst om het achtergrondgeluid te verminderen. Kalibratie van de veerconstante van de AFM-cantileverLaad de sledesonde (voorbereid volgens de stappen 1-8 in sectie 2, deel 1, bevestiging van een kraal van 5,7 μm aan de AFM-vrijdragende tip) op de AFM-kop volgens de instructies van de fabrikant. Reinig de cantilever met 70% ethanol om vervuiling van de cantilever tijdens de meting te voorkomen. Was uitgebreid met gedestilleerd water om resterende ethanol uit de punt te verwijderen. Schakel de contactmodus in en selecteer force mapping als meetmethode. Open alle relevante vensters (Z Stepper Motors, Gemotoriseerde Stage Control, Data Viewer, Force Scan Map Oscilloscoop, Laser Alignment en Camera venster) in de software tabbladen door op de bijbehorende knoppen te klikken. Monteer een schone glazen glijbaan met 1,2 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een gebied van ongeveer 2 cm x 4 cm afgebakend met een hydrofobe markerpen. Monteer de AFM-kop op het microscooppodium en zorg ervoor dat de cantilever volledig is ondergedompeld in PBS. Richt het doel op de uitkragingstip. Verminder de intensiteit van het doorgelaten licht op de microscoop om een beter beeld te krijgen van de laserpositie op de monitor. Richt de laser op het doorschijnende uiteinde van de cantilever (waaronder de bolvormige kraal is bevestigd) en lijn de spiegel uit met behulp van de knoppen op de AFM-kop om de totale intensiteit van de laserstraal op de detector te maximaliseren (weergegeven door de som in het laseruitlijningsvenster ). Lijn de fotodiodedetector uit met behulp van de knoppen op de AFM-kop om de laser in het midden te plaatsen. Laat de cantilever 15 minuten stabiliseren voordat u doorgaat met de kalibratie. Open de kalibratiemanager en plaats het type uitkraging, de afmetingen van de cantilever en de omgevingscondities. Kalibreer de veerconstante en gevoeligheid (ook bekend als inverse optische hefboomgevoeligheid, InvOLS) door op Kalibreren te klikken. Bevestig de nauwkeurigheid van de veerconstante die na kalibratie wordt verkregen met de verklaring van de fabrikant. Kalibreer de cantilever in contactloze modus (kalibratie wordt uitgevoerd door de software met behulp van de thermische stelling afgeleid door Sader et al.58).OPMERKING: De veerconstante van de cantilever vertegenwoordigt de stijfheid van de cantilever en wordt gegeven door de weerstandskracht van de cantilever als deze vervormt per de vervormingslengte in termen van N / m. De gevoeligheid van de cantilever geeft de waarde weer van de fotodioderespons (in volt) als reactie op de afbuiging van de cantilever (in nanometers) en wordt meestal gepresenteerd in termen van nm/V59. In een contactloze modus wordt het thermische ruisspectrum na kalibratie automatisch geregistreerd en uitgerust met de hydrodynamische functie60 door de AFM-besturingssoftware. De fitting levert de kalibratieparameters, namelijk de veerconstante en de InvOLS. De veerconstante van de SD-qp-BioT-TL-10 cantilever die in dit onderzoek werd gebruikt, was 0,09 N/m, zoals opgegeven door de fabrikant. 3. Monstervoorbereiding II Ontdooi de bevroren profielen (bewaard bij −80 °C, zoals beschreven in punt 1, Monstervoorbereiding I) bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Bevestig de secties met ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS gedurende 10 minuten bij 4 °C gevolgd door uitgebreid wassen (5x) met 1x PBS. Veeg resterende PBS rond de sectie met een tissue en markeer een grens van ongeveer 2 cm x 4 cm rond het levergedeelte met een hydrofobe markerpen. Bedek het monster met 1x PBS (zorg ervoor dat het afgebakende gebied ~1,2 ml 1x PBS bevat). Gebruik het voorbeeld voor AFM-metingen.OPMERKING: Aangezien PFA een gevaarlijke chemische stof is, moet het met zorg worden behandeld om contact met de huid of ogen te voorkomen. Om de giftige dampen te voorkomen, moeten alle procedures met betrekking tot PFA worden uitgevoerd in een gecertificeerde chemische zuurkast of een andere goedgekeurde geventileerde ruimte. 4. Meting Schakel automatisch opslaan in door naar het tabblad Instellingen te gaan en een vinkje te maken op Automatisch opslaan. Geef de bestandsnaam en map op voor het opslaan van de meetbestanden door naar het tabblad Instellingen te gaan en vervolgens op Instellingen opslaan te klikken. Laad het monster (bereid overeenkomstig punt 3, Monstervoorbereiding II). Benader het weefseloppervlak met de AFM-cantilever door de laser in te schakelen en op de approach-toets te klikken. Nadat de punt in contact is met het weefseloppervlak, trekt u de uitkragingspunt in zodat de punt in de focus van het doel blijft (door op de retractietoets te klikken, die de uitkraging naar de bovenkant van het piëzo-bereik intrekt). Lijn de detector opnieuw uit als de laserpositie wordt verplaatst van het midden op het laseruitlijningsvenster . Schakel de laser uit en bedek het optische veld van de microscoop met AFM-meetkaarten door op het tabblad Accessoires te klikken en vervolgens Directe optische kalibratie overlay te selecteren. Klik in het volgende venster op Volgende om een reeks afbeeldingen te maken van de cantilever die een specifiek gebied scant. Klik nogmaals op Volgende om naar het volgende venster te gaan. Klik in de eerste afbeelding handmatig op het midden van de punt van de cantilever om de tippositie in de software weer te geven. De cirkel die de tippositie weergeeft, kan in grootte worden gemanipuleerd door de straal aan te geven om de nauwkeurigheid te vergroten. Klik op Kalibreren om automatisch de stand van de uitkragingpunt in alle afbeeldingen te detecteren. Bevestig de nauwkeurigheid van tipdetectie door de afbeeldingen door te nemen. Klik op Volgende en vervolgens op Voltooien om de optische overlay te voltooien en de reeks afbeeldingen op te slaan die tijdens optische kalibratie zijn vastgelegd. Trek de uitkraging verder in om botsing met hogere oppervlakken op de glijbaan te voorkomen. Verplaats het werkgebied om een collageenrijk gebied te plaatsen in het groene vak dat zichtbaar is op het tabblad Gegevensviewer met behulp van de gepolariseerde afbeelding. Selecteer het collageenrijke gebied door er een rechthoek omheen te maken met een lange druk op de linkermuisknop in het opgegeven groene vak. Definieer de afmetingen, richting en resolutie van het geselecteerde gebied onder het tabblad Raster aan de linkerkant. Klik op Nieuw scangebied bevestigen om het geselecteerde gebied in te stellen als meetgebied. Houd IGain – en PGain-parameters van de feedbacklus-op standaardwaarden, als er geen grote instabiliteiten worden gepresenteerd in de vorm van systeemovergevoeligheid. Als u dit protocol wilt volgen, stelt u IGain in op 50 Hz en PGain op 0,001. Stel het instelpunt in op 1 nN.OPMERKING: Setpoint is de kracht van de tip-surface interactie tijdens de stationaire toestand. Voor de meeste zachte monsters (cellen, gels en weefsels) zijn instelwaarden in het bereik van 0,5-2,0 nN geschikt. Selecteer de relatieve instelpuntwaarde op basis van de mechanische eigenschappen van het bestudeerde materiaal en de stijfheid van de cantilever. Voor dit protocol stelt u de waarde in op 5 nN.OPMERKING: Het relatieve instelpunt vertegenwoordigt de maximale kracht van interactie, wanneer de piek van de kracht-afstandscurve wordt bereikt en de tipbeweging terugkeert naar de basislijn. Voor zachte materialen (1-50 kPa) wordt deze parameter ingesteld in eenheden van nanonewton (nN). Bovendien is voor een zachte cantilever (met een veerconstante van 0,05 N/m tot 0,35 N/m) de maximale kracht die kan worden uitgeoefend ongeveer 50 nN. Pas de setpoint- en relatieve instelpuntwaarden dienovereenkomstig aan.Zorg ervoor dat de gegeven instelpuntwaarde niet leidt tot een inkepingsdiepte die groter is dan de straal van het bolvormige indruklichaam, anders kan het inspringingsoppervlak niet goed worden gedefinieerd bij de berekening van de modulus van Young. Bereken de gemiddelde waarde van de inspringingsdiepte na de eerste run van de inkepingen; zie Sectie 5, Gegevensanalyse, voor meer informatie over het verwerken van de geregistreerde gegevens. Pas indien nodig de instelpuntwaarde aan. Stel Basislijn aanpassen in als 5.OPMERKING: Hier verwijst de basislijn naar de mate van polynoom die wordt gebruikt voor het aanpassen van de naderings- en retractcurven. Het instellen van de basislijn op 5 past de curven aan op hoge resolutie en zorgt zo voor het vastleggen van achtergrondgeluid tijdens metingen. Selecteer de lengte van het vrijdragende uurwerk in de Z-as (Z-lengte) op basis van de oppervlaktetopografie van het monster. Om dit protocol te volgen, stelt u de Z-lengte in op 15 μm.OPMERKING: Een hoge waarde (bijv. 15 μm) vermindert de meetgevoeligheid, maar is meestal vereist voor monsters met een zeer onregelmatig oppervlak zoals fibrotisch leverweefsel. Stel Z-beweging in op Constante duur.OPMERKING: Z-beweging kan ook worden ingesteld op Constante snelheid om gegevens met betrekking tot Z-beweging (Verlengsnelheid en Verlengtijd) in een andere modus weer te geven. Stel de verlengtijd in op 1 s. Stel Verlengingsvertraging en Intrekkingsvertraging in op 0.OPMERKING: Gebruik verlengsnelheden van > 5,0 μm/s voor zeer zachte materialen61, omdat lagere inkepingssnelheden resulteren in een meer viskeuze en minder elastische respons van zachte oppervlakken. Extension Delay en Retraction Delay zijn parameters die kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van specifieke interactie tussen de cantilevertip en het substraat (bijv. interacties van een eiwit geïmmobiliseerd op het oppervlak van de cantilever met eiwitten geïmmobiliseerd op het diaoppervlak). Stel samplefrequentie in op 5000 Hz.OPMERKING: De samplefrequentie verwijst naar de frequentie van punten die worden geregistreerd op een volledige naderings-retractcurve. Stel dit in op een hoge waarde (bijv. 5000 Hz) om te voorkomen dat bepaalde delen van de curven ontbreken vanwege hun extreem snelle overgang. Markeer de Z Closed Loop met een Tick om een feedback loop-systeem mogelijk te maken, dat zorgt voor een afstand tussen het monsteroppervlak en de cantilevertip. Ontkoppel de gemotoriseerde fase door Engage en Klik op Approach te deselecteren om het monster met de cantilever te benaderen. Klik op Scannen starten om te beginnen met het verzamelen van kracht-afstandscurven in het gebied dat is ingesteld in stap 6; Sectie 4, Meting. 5. Data-analyse Analyseer de verkregen gegevens met behulp van de open-source software “AtomicJ” (die kan worden gedownload van https://sourceforge.net/projects/jrobust/).OPMERKING: Het ondersteunt bestanden verzameld van Agilent Technologies, JPK Instruments of Bruker atomic force microscopen. Laad de krachtcurves in het programma door te klikken op het pictogram proceskrachtcurven en kaarten in AtomicJ (Supplemental Figure S2A, x). Voeg in de verwerkingsassistent de te analyseren kaarten toe door op de knop Toevoegen te klikken (aanvullende figuur S2A, y). Klik op Volgende nadat de kaarten zijn geladen (aanvullende figuur S2A, z). Geef de verwerkingsinstellingen in het volgende venster op volgens de onderstaande stappen (overeenkomend met de stappen in Aanvullende figuur S2B, stappen 1-11):Schat het contactpunt tussen het monster en de cantilever handmatig door berekening of automatisch met behulp van een reeks passende curveparameters. Als u dit protocol wilt volgen, gebruikt u de automatische schatting van het contactpunt. Bepaal het contactpunt tussen de cantilever en het monster met behulp van de klassieke gerichte rastermethode. Selecteer de schattingsmethode om de beste bepaling van het contactpunt te verkrijgen op basis van de kwaliteit van de gemeten krachtcurven, die empirisch moet worden bepaald tijdens de optimalisatie van gegevensanalyse. Als u dit protocol wilt volgen, gebruikt u de methode Modelonafhankelijk. Pas de krachtinspringingscurve aan met behulp van een klassiek model (gebruik Klassiek L2 voor modelaanpassing om dit protocol te volgen).OPMERKING: Model fit en Contact estimator zijn parameters die bepalen hoe de curven door de software worden aangebracht en hoe het contactpunt wordt ingesteld in de gemonteerde curve, respectievelijk. Voor deze metingen werd de optie Klassiek gebruikt, die de regressie van de kleinste kwadraten gebruikt. Dit verwerkt elk laagkrachtig punt op de curve als een proefcontactpunt en past een polynoom in het gebied vóór het proefcontactpunt. Vervolgens past het juiste contactmodel in de verzamelde krachtinspringingsgegevens. Het punt dat de laagste som van kwadraten geeft, wordt verondersteld als contactpunt. Andere methoden kunnen worden gebruikt op basis van de kwaliteit van de verkregen krachtcurven62,63. Stel de pasvorm van het model in op de curve Terugtrekken . Stel de verhouding van Poisson in op 0,45, zoals aanbevolen voor zachte weefsels zoals lever24. Stel de pasvorm van de curve in met een basislijngraad van 3 en een contactgraad van 1. Wijzig de mate van polynomiale fit op basis van de schaal van afwijkingen van de curven van het model. Selecteer het model dat wordt gebruikt om in de trekcurven te passen. Gebruik het Sneddon-model , dat de modulus van Young berekent op basis van vergelijking (1) en vergelijking (2):(1)δ = (2)waar F kracht is, E de modulus van Young, v de Poisson-verhouding van het monster, δ de inkepingsdiepte is, a de contactradius en R de bolstraal62,63. Vul de straal van de bolvormige punt in micrometers in (2,9 μm in dit protocol). Laad de veerconstante en InvOLS uit de gegevensbestanden door inlezen in te schakelen (vink de selectievakjes aan). Klik op Voltooien.OPMERKING: De geanalyseerde gegevens worden gepresenteerd in de vorm van kaarten van verticale afbuiging, hoogte, adhesie, contactkracht, vervorming, adhesiekracht, R2-waarden , helling, Young’s modulus, overgangsinspringing, overgangskracht en contactpositie berekend voor elke krachtcurve (aanvullende figuur S3, linksboven). Twee extra vensters geven krachtcurven en ONBEWERKTE waarden weer (aanvullende figuur S3, respectievelijk rechterbovenhoek en onderste deelvenster). Sluit krachtcurven uit waarbij de cantilever het oppervlak van het levergedeelte verkeerd benaderde. Om deze te identificeren, zoekt u naar curven met veel ruis, afwijkende vormen en/of onvolledige benadering, zoals aangetoond in figuur 3 en elders in detail besproken46. Figuur 3: Voorbeelden van representatieve krachtverplaatsingscurven. (A,B) Representatieve interpreteerbare krachtcurven voor stijvere (A; E = 10,5 kPa) en zachter (B; E = 1,78 kPa) gebieden die geschikt zijn voor analyse. (C-F) Representatieve niet-interpreteerbare grafieken die moeten worden uitgesloten van de analyse vanwege (C-E) onjuiste benadering of (F) hogere ruis. Zoals aangegeven in de legenda onder (A), tonen rode bochten de nadering van de cantilever en groene curven de terugtrekking van de cantilever. Zwarte lijnen tonen de aanpassing van de onttrekkingscurve van de cantilever. De helling van de zwarte lijnen komt overeen met de modulus van Young. De rode en blauwe punten komen overeen met respectievelijk het contactpunt en het overgangspunt. Het contactpunt is het laatste contactpunt tussen de cantilever en het substraat tijdens het terugtrekken, terwijl het overgangspunt de overgang van de cantilever van nadering naar terugtrekking beschrijft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

Licht gefixeerde, 30 μm dikke leversecties verkregen van controlemuizen en muizen met milde of gevorderde fibrose (geïnduceerd door injectie van CCl4 gedurende respectievelijk 3 weken of 6 weken,49) werden onderzocht met AFM zoals beschreven in dit protocol. Collageenvezels dicht bij centrale aderen werden geselecteerd voor het meten van stijfheidskaarten. Gebieden dicht bij de centrale aderen, die overeenkomen met de gebieden waar collageenvezels in met CCl4 behandelde dieren zich gewoonlijk vormen, werden geanalyseerd in controlelevers (figuur 4A). De verdeling van Young’s moduli was reproduceerbaar over verschillende controlelevers en collageenrijke gebieden binnen een enkele leversectie (figuur 4B: linker vioolplot). Bij met CCl4 behandelde dieren vertoonden stijfheidskaarten die overeenkomen met de pericentrale gebieden van collageenafzettingen significant hogere waarden van Young’s moduli in vergelijking met equivalente gebieden in controlemuizen (figuur 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa mediaan Young’s moduluswaarden voor controle versus 3 weken CCl4-behandelde muis; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa mediaan Young’s moduluswaarden voor controle versus 6 weken CCl4 -behandelde muis; p = 0,02). Bovendien was er een significante toename van de waarden van Young’s moduli bij langere CCl4-behandeling (figuur 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa mediaan Young’s moduluswaarden gedurende 3 weken vs. 6 weken CCl4-behandelde muis; p = 0,04). Dit toont een geleidelijke verstijving van collageenafzettingen met fibroseprogressie en dat AFM-metingen de fibrogenese weerspiegelen. Om het effect van langdurige opslag van OCT-ingebedde leversecties op de mechanische eigenschappen van collageenvezels te evalueren, hebben we de stijfheid van collageenvezels gemeten in secties van met CCl4 behandelde muizen, die gedurende 2 weken of 3 maanden na het snijden bij −80 °C op de dia werden bewaard (figuur 5). AFM-metingen toonden significant lagere waarden van Young’s moduli in collageenrijke gebieden voor secties die gedurende 3 maanden werden bewaard in vergelijking met die verkregen uit secties gemeten binnen 2 weken na monstersectie (figuur 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa mediaan Young’s moduluswaarden gedurende 2 weken versus 3 maanden opslag; p < 0,001). Het is dus belangrijk om de mechanische eigenschappen van het leverweefsel te meten kort nadat de secties zijn bereid uit de OCT-ingebedde leverlobben. Figuur 4: AFM-metingen onthullen progressieve verstijving van collageenrijke gebieden die correleren met langdurige CCl4-behandeling . (A) Leversecties van controlemuizen en muizen behandeld met CCl4 gedurende 3 weken of 6 weken werden gebruikt om de mechanische eigenschappen van collageenrijke gebieden te meten. De ingepakte gebieden van leversecties die worden weergegeven in de gepolariseerde microscopiebeelden (links) zijn collageenrijke scangebieden (of overeenkomstige gebieden in de controlelever) die zijn geselecteerd voor AFM-metingen (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). De moduluskaarten van de Young met kleurschalen die overeenkomen met deze boxed areas worden aan de rechterkant weergegeven, inclusief histogrammen van Young’s moduluswaarden uit deze kaarten; inzetverstrooiingsdiagrammen tonen waarden > 10 kPa voor elke voorwaarde. De verstijving van de lever wordt gevisualiseerd als een geleidelijke verschuiving naar rechts in de histogramverdeling en een hogere frequentie van punten in de inzetverstrooiingsplot. Schaalbalk = 20 μm. (B) Vioolplots tonen de verdeling van elastische moduli uit drie gebieden gemeten voor elke toestand (links) en samengevatte elastische moduli-waarden uit alle drie de kaarten (rechts). Vioolplots tonen de mediaan (rode lijn),25e percentiel en 75e percentiel (zwarte lijnen); stippen vertegenwoordigen de gemiddelde waarden van individuele kaarten uit gebieden 1-3. De gepresenteerde p-waarden werden berekend met behulp van een Student’s t-test uitgevoerd op middelen. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; CCl4 = tetrachloorkoolstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Langdurige opslag van leversecties leidt tot een afname van de stijfheid van collageenrijke gebieden. Leversecties (bereid uit muizen behandeld met CCl4 gedurende 2 weken) bewaard bij −80 °C gedurende 2 weken of 3 maanden werden gebruikt om de modulus van Young te meten. Gepolariseerde microscopiebeelden (links) met vakken die de collageenrijke gebieden aangeven die worden gebruikt voor AFM-metingen (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Corresponderende Young’s modulus kaarten met kleurenschalen (rechts). Histogrammen tonen young’s moduluswaarden verzameld uit 4-6 gebieden in elk monster; inzetverstrooiingsgrafieken tonen waarden >10 kPa voor elke voorwaarde. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; CCl4 = tetrachloorkoolstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur S1: Methode voor het wijzigen van de cantilever met een melaminehars microkraal. (A) Getekend schema illustreert de bevestiging van een bolvormige kraal aan de punt van de cantilever. Voor een stapsgewijze beschrijving, zie Sectie 2, Deel 1, Bevestiging van een kraal van 5,7 μm aan afm-sledepunt. (B) Microscopiebeeld van een bolvormige kraal van 5,7 μm die is bevestigd aan de vrijdragende punt die van boven (links) en lateraal zicht (rechts) wordt weergegeven. Schaalstaven = 20 μm. Afkortingen: AFM = atomic force microscopy; RT = kamertemperatuur. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur S2: Gegevensanalyse in AtomicJ. (A) De volgorde van stappen die moeten worden gevolgd voor het openen van stijfheidskaarten in AtomicJ. Een enkele linkerklik op de proceskrachtcurven en -kaarten (x) opent de verwerkingsassistent. Bestanden kunnen naar de verwerkingsassistent worden geladen door op toevoegen (y) te klikken en de vereiste bestanden te selecteren. Klik op volgende (z) om door te gaan naar de volgende stap. (B) Parameters voor het passen van curven, het geschikte model van de contactmechanica en de AFM-instellingen die tijdens de meting worden gebruikt. Stap 1-11 verwijst naar overeenkomstige subpunten die worden beschreven in protocolstap 3, sectie 5, Gegevensanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur S3: Overzicht van geanalyseerde gegevens in AtomicJ. Het voorbeeld van geanalyseerde gegevens toont stijfheidskaarten (venster linksboven), krachtcurven (venster rechtsboven) en onbewerkte gegevens (onderste venster). Afkorting: AFM = atomic force microscopy. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het gepresenteerde protocol biedt een stapsgewijze reproduceerbare methode voor AFM-meting van normaal en fibrotisch leverweefsel van muizen. Gekoppelde polarisatiemicroscopie biedt een hoge ruimtelijke precisie en maakt visualisatie van collageenvezels mogelijk vanwege hun birefringence. Verder wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van de analyse van de verkregen krachtcurven. AFM-stijfheidsmeting kan op cellulair niveau worden uitgevoerd, waardoor lokale veranderingen in de mechanische eigenschappen van leverweefsel als gevolg van de ontwikkeling van fibrotische ziekten kunnen worden gecontroleerd. Leverfibrose is geen homogeen proces dat het hele orgaan beïnvloedt. Integendeel, gebieden van collageenrijke fibrotische septa worden afgewisseld met gebieden met lage of geen collageenafzettingen. Veranderingen in stijfheid zijn dus specifiek voor de lokale micro-omgeving en beïnvloeden alleen cellen lokaal in contact met gebieden die door letsel zijn beschadigd. Deze microschaal van stijfheid heterogeniteit is ook zichtbaar in de details van de moduluskaarten van AFM Young, waar punten van hoge stijfheid grenzen aan de gebieden met bijna normale stijfheid. Deze variatie laat zien dat zelfs het gebied van collageen littekenweefsel niet mechanisch homogeen is en vereist dat AFM-metingen op cellulair niveau worden gekarakteriseerd (figuur 4).

Het gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om leverstijfheid door AFM onafhankelijk van de leververzameling te meten, omdat de hele leverkwabben ingebed in OCT gedurende een langere periode bij −80 °C kunnen worden bewaard. Zodra het weefsel echter is gesneden, raden we aan om de monsters binnen ~ 2 weken te meten, omdat we een geleidelijke verzachting van weefselsecties hebben waargenomen die gedurende langere tijd zijn opgeslagen (figuur 5).

De AFM uitgerust met polarisatiemicroscopie maakt het mogelijk om het interessegebied binnen de leverlobbenstructuur nauwkeurig te lokaliseren. Het heeft echter ook enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten. De hier verkregen stijfheidswaarden werden gemeten bij kamertemperatuur. We gaan ervan uit dat de effecten van temperatuur op de mechanische eigenschappen van zacht weefsel klein zullen zijn; dit kan echter een van de redenen zijn voor verschillen tussen de gerapporteerde in vivo waarden van mechanische eigenschappen van leverweefsels en de waarden in deze studie.

Bovendien maakt dit protocol AFM-analyse van leverweefsel tot 3 uur mogelijk, wat een milde fixatie van het weefsel vereist. De milde fixatie van weefselsecties, evenals de vries-dooicyclus, zal hoogstwaarschijnlijk de absolute waarden van Young’s modulus beïnvloeden. De gerapporteerde waarden van Young’s moduli kunnen dus afwijken van in vivo waarden. Verdere studies zijn nodig om het protocol te optimaliseren voor het meten van absolute waarden van Young’s modulus uit leversecties, wat kan worden bereikt door een andere methode voor fixatie van leverweefsel64.

Niettemin zagen we een toenemende stijfheid van collageenrijke gebieden in de levers van muizen die gedurende 3 weken met CCl4 werden behandeld in vergelijking met 6 weken. Dergelijke veranderingen komen overeen met fibroseprogressie tijdens langdurig letsel (figuur 4) en laten zien dat relatieve verschillen tussen verschillende behandelingen kunnen worden onderzocht met behulp van het gepresenteerde protocol. Dit is in overeenstemming met de observaties van Calò et al., die aantoonden dat mild gefixeerde leversecties vergelijkbare verschillen in stijfheidswaarden vertonen tussen collageenrijke en collageenarme gebieden als in vers weefsel25.

We gebruikten de SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (theoretische veerconstante ~0,09 N/m) gemodificeerd met een bolvormige punt met een diameter van 5,7 μm om mechanische verstoring van het leverweefsel tijdens metingen te minimaliseren. Een kraal van 5,7 μm maakte voldoende inkeping van het monster mogelijk om de stijfheid te onderzoeken met behoud van de integriteit. Een kraal met een kleinere diameter kan na verschillende optimalisaties worden gebruikt voor het verkrijgen van een hogere resolutie in de stijfheidskaarten, maar kan leiden tot verdere overschatting van de moduluswaarden van de Young (voor meer details, zie Crichton et al.65). Met behulp van het gespecificeerde cantilever-kralenensemble konden we de monsterstijfheid karakteriseren in een breed bereik, van tientallen eenheden Pa tot ~ 100 kPa.

Het model van Sneddon werd gebruikt om Young’s modulus af te leiden uit krachtcurves, omdat het analyse van diepe inkepingen met colloïdale sondesmogelijk maakt 62. Het model van Sneddon lijdt, in tegenstelling tot het model van Hertz, niet onder de beperking dat de contactradius veel kleiner moet zijn dan de bolstraal. Verder wordt ervan uitgegaan dat de dikte van het monster meerdere malen groter is dan de inkepingsdiepte30,66. In deze studie was de inkeping ~2 μm met een kraalgrootte van 5,7 μm en een monsterdikte van 30 μm in collageenrijke gebieden; het model van Sneddon was dus toepasselijk. Andere modellen63 gezien de hechtingskracht tussen punt en substraat kunnen worden gebruikt voor verschillende soorten weefsels.

Analyse in AtomicJ implementeert correcties voor de eindige dikte van de monsters om de bijdrage van een substraat te minimaliseren terwijl young’s modulus62,67 wordt afgeleid. Bij de analyse van de verkregen krachtcurven gebruikten we een enkele Poisson-verhouding van 0,45, die eerder is aanbevolen voor wekedelenorganen24. Deze benadering heeft geen significant effect op de berekende waarden van Young’s modulus, aangezien de verandering in de waarde van Poisson’s ratio van 0,4 tot 0,5 slechts resulteert in een 0,893x afname van Young’s moduluswaarden berekend volgens de Sneddon’s vergelijking. Gezien de meervoudige verschillen in Young’s modulus tussen de verschillende duur van CCl4-behandelingen, zijn de fouten die worden geproduceerd door het benaderen van de verhouding van Poisson slechts marginaal.

We gebruikten trekcurven om stijfheidswaarden te berekenen, omdat we geïnteresseerd waren in de elastische reactie van het weefsel op de belasting die door de cantilever wordt geleverd in plaats van in de plastic reactie op inkeping68. Vanwege de visco-elastische respons van het zachte weefsel kunnen passende terugtrekkingscurven de modulus van Young overschatten, waarmee rekening moet worden gehouden. Bovendien hebben we waargenomen dat data-analyse met naderingscurves vergelijkbare trends in stijfheidswaarden tussen fibrotische en controlegebieden oplevert, hoewel de absolute waarden dienovereenkomstig lager zijn (gegevens niet weergegeven).

Tijdens het optimaliseren van het protocol hebben we verschillende stappen geïdentificeerd die cruciaal zijn voor de reproduceerbaarheid van de metingen. Ten eerste is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de kraal zich ongeveer in het midden van de doorschijnende punt bevindt terwijl deze aan de uitkraging wordt bevestigd. Dit voorkomt mogelijke mechanische onbalans tijdens inkepingen. Ten tweede, tijdens leverfixatie met PFA, is het noodzakelijk om de tijdslimieten voor ontdooien en fixatie strikt te volgen. Het veranderen van de timing van deze stap kan de mechanische eigenschappen van weefselsecties ernstig beïnvloeden. Ten derde moet de cantilever herhaaldelijk worden gekalibreerd met continue bewaking en invoer van gelijktijdige temperatuurwaarden om te voorkomen dat artefacten optreden in stijfheidswaarden als gevolg van temperatuurschommelingen. Ten slotte mag een enkele leversectie niet langer dan 3 uur na bereiding worden gemeten, omdat overlayd PBS over langere perioden kan verdampen. Lezers kunnen de tabel voor probleemoplossing (tabel 3) raadplegen voor het oplossen van problemen die zich voordoen tijdens de AFM-meting, die ook uitgebreid wordt besproken in Norman et al.46.

Tabel 3: Handleiding voor probleemoplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Het gepresenteerde protocol maakt reproduceerbaar AFM-onderzoek van leverweefsel mogelijk. Het heeft het potentieel om informatie te onthullen over de ontwikkeling en uiteindelijke regressie van fibrotische leverziekte op microscopisch niveau en kan bijdragen aan de ontwikkeling van therapieën gericht op fibrotische littekengebieden gevormd tijdens de progressie van chronische leverziekte.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Subsidiebureau van tsjechië (18-02699S), het institutioneel onderzoeksproject van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (RVO 68378050) en meys CR-project NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, gefinancierd door MEYS CR infrastructuurproject LM2018127 en European Regional Development Fund-Project “UP CIISB” (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) heeft de metingen bij de CF Nanobiotechnologie, CEITEC MU, financieel ondersteund. We erkennen ook de Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praag, Tsjechië, ondersteund door MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) en RVO: 68378050-KAV-NPUI, voor hun ondersteuning bij de microscopiebeeldvorming die hierin wordt gepresenteerd.

Materials

AFM head Bruker JPK nanowizard 3
Cameras Andor Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)
The Imagingsource  S/N:12310015
Cantilever SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors S/N:73750F05
Cryotome Leica  CM1950
Epoxy resin glue (Long working time ) Bison epoxy universal
Melamine beads; diameter, 5.7 um Microparticles, GmbH MF-R-5.7
Microscope Olympus  IX81
Hydrophobic  slide marker SuperHT PAP PEN
Software JPK nanowizard  v6.1.151
AtomicJ v2.3.1
Superfrost slides Thermoscientific ref no. J1800AMNZ
System Ubuntu 14.04.5 LTS
Vibration isolation control unit Tablestable AVI-200-S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanden Berghe, G. The role of the liver in metabolic homeostasis: Implications for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Dis. 14 (4), 407-420 (1991).
  2. Stanger, B. Z. Cellular homeostasis and repair in the mammalian liver. Annual Reviews of Physiology. 77, 179-200 (2015).
  3. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annual Review of Pathology. 6, 425-456 (2011).
  5. Georges, P. C., et al. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: Implications for fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (6), 1147-1154 (2007).
  6. Perepelyuk, M., et al. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (6), 605-614 (2013).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (5), 1394-1400 (2008).
  8. Olsen, A. L., et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (1), 110-118 (2011).
  9. Sandrin, L., et al. Transient elastography: A new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (12), 1705-1713 (2003).
  10. Ling, W., et al. Effects of vascularity and differentiation of hepatocellular carcinoma on tumor and liver stiffness: In vivo and in vitro studies. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (4), 739-746 (2014).
  11. Wong, V. W. S., et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51 (2), 454-462 (2010).
  12. Cha, S. W., et al. Nondiseased liver stiffness measured by shearwave elastography a pilot study. Journal of Ultrasound in Medicine. 33 (1), 53-60 (2014).
  13. Castera, L., Forns, X., Alberti, A. Non-invasive evaluation of liver fibrosis using transient elastography. Journal of Hepatology. 48 (5), 835-847 (2008).
  14. Chang, W., et al. Liver fibrosis staging with MR elastography: Comparison of diagnostic performance between patients with chronic hepatitis B and those with other etiologic causes. Radiology. 280 (1), 88-97 (2016).
  15. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Clinical applications. Journal of Computer Assisted Tomography. 37 (6), 887-896 (2013).
  16. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Technique, analysis and clinical applications. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (3), 544-555 (2013).
  17. Venkatesh, S. K., Wang, G., Teo, L. L. S., Ang, B. W. L. Magnetic resonance elastography of liver in healthy Asians: Normal liver stiffness quantification and reproducibility assessment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 1-8 (2014).
  18. Lee, D. H., Lee, J. M., Han, J. K., Choi, B. I. MR elastography of healthy liver parenchyma: Normal value and reliability of the liver stiffness value measurement. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 38 (5), 1215-1223 (2013).
  19. Mueller, S. Liver stiffness: A novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine. Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
  20. Goodman, Z. D. Grading and staging systems for inflammation and fibrosis in chronic liver diseases. Journal of Hepatology. 47 (4), 598-607 (2007).
  21. Salameh, N., et al. Hepatic viscoelastic parameters measured with MR elastography: Correlations with quantitative analysis of liver fibrosis in the rat. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 26 (4), 956-962 (2007).
  22. Yin, M., et al. Quantitative assessment of hepatic fibrosis in an animal model with magnetic resonance elastography. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (2), 346-353 (2007).
  23. Bastard, C., et al. Transient micro-elastography: A novel non-invasive approach to measure liver stiffness in mice. World Journal of Gastroenterology. 17 (8), 968-975 (2011).
  24. Barnes, S. L., Lyshchik, A., Washington, M. K., Gore, J. C., Miga, M. I. Development of a mechanical testing assay for fibrotic murine liver. Medical Physics. 34 (11), 4439-4450 (2007).
  25. Calò, A., et al. Spatial mapping of the collagen distribution in human and mouse tissues by force volume atomic force microscopy. Scientific Reports. 10, 15664 (2020).
  26. Desai, S. S., et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology. 64 (1), 261-275 (2016).
  27. Kostallari, E., et al. Stiffness is associated with hepatic stellate cell heterogeneity during liver fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 322 (2), 234-246 (2022).
  28. Binnig, G., Qaute, C. F., Gerber, C. Atomic force microscope. Physical Review Letters. 56 (9), (1986).
  29. Johnson, K. L. . Contact Mechanics. , (1985).
  30. Asgari, M., Latifi, N., Giovanniello, F., Espinosa, H. D., Amabili, M. Revealing layer-specific ultrastructure and nanomechanics of fibrillar collagen in human aorta via atomic force microscopy testing: Implications on tissue mechanics at macroscopic scale. Advanced NanoBiomed Research. 2 (5), 2100159 (2022).
  31. Amabili, M., et al. Microstructural and mechanical characterization of the layers of human descending thoracic aortas. Acta Biomaterialia. 134, 401-421 (2021).
  32. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: Effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomaterialia. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  33. Geerligs, M., et al. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. 44 (6), 1176-1181 (2011).
  34. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  35. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  36. Babu, P. K. V., Radmacher, M. Mechanics of brain tissues studied by atomic force microscopy: A perspective. Frontiers in Neuroscience. 13, 600 (2019).
  37. del Mar Vivanco, M. . Mammary Stem Cells: Methods and protocols. , (2015).
  38. Zanetti-Dällenbach, R., et al. Length scale matters: Real-time elastography versus nanomechanical profiling by atomic force microscopy for the diagnosis of breast lesions. Biomed Research International. 2018, 3840597 (2018).
  39. Lopez, J. I., Kang, I., You, W. -. K., McDonald, D. M., Weaver, V. M. In situ force mapping of mammary gland transformation. Integrative Biology. 3 (9), 910-921 (2011).
  40. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnol. 4 (3), 186-192 (2009).
  41. Borin, D., Pecorari, I., Pena, B., Sbaizero, O. Novel insights into cardiomyocytes provided by atomic force microscopy. Seminars in Cell & Developmental Biology. 73, 4-12 (2018).
  42. Lachaize, V., et al. Atomic Force Microscopy: An innovative technology to explore cardiomyocyte cell surface in cardiac physio/pathophysiology. Letters in Applied NanoBioScience. 4 (4), 321-324 (2015).
  43. Lieber, S. C., et al. Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (2), 645-651 (2004).
  44. Guedes, A. F., et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients. Nature Nanotechnology. 11 (8), 687-692 (2016).
  45. Zhu, Y., Dong, Z., Wejinya, U. C., Jin, S., Ye, K. Determination of mechanical properties of soft tissue scaffolds by atomic force microscopy nanoindentation. Journal of Biomechanics. 44 (13), 2356-2361 (2011).
  46. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  47. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  48. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of Young’s modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  49. Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C., Weiskirchen, R. The carbon tetrachloride model in mice. Laboratory Animals. 49, 4-11 (2015).
  50. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  51. Ribeiro, J. F., dos Anjos, E. H. M., Mello, M. L. S., de Campos Vidal, B. Skin collagen fiber molecular order: A pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. PLoS One. 8 (1), 54724 (2013).
  52. Ozkan, A., et al. The influence of chronic liver diseases on hepatic vasculature: A liver-on-a-chip review. Micromachines. 11 (5), 487 (2020).
  53. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  54. Khajehahmadi, Z., et al. Liver stiffness correlates with serum osteopontin and TAZ expression in human liver cirrhosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 1465 (1), 117-131 (2020).
  55. Tian, M., et al. The nanomechanical signature of liver cancer tissues and its molecular origin. Nanoscale. 7 (30), 12998-13010 (2015).
  56. Zhao, G., et al. Mechanical stiffness of liver tissues in relation to integrin β1 expression may influence the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 102 (5), 482-489 (2010).
  57. Gang, Z., Qi, Q., Jing, C., Wang, C. Measuring microenvironment mechanical stress of rat liver during diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis by atomic force microscope. Microscopy Research and Technique. 72 (9), 672-678 (2009).
  58. Sader, J. E., et al. Spring constant calibration of atomic force microscope cantilevers of arbitrary shape. The Review of Scientific Instruments. 83 (10), 103705 (2012).
  59. JPK Instruments. A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis. JPK Instruments Technical Note. JPK Instruments. , 1-8 (2016).
  60. van Eysden, C. A., Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids. Journal of Applied Physics. 101, 044908 (2015).
  61. Kim, Y., Yang, Y. I., Choi, I., Yi, J. Dependence of approaching velocity on the force-distance curve in AFM analysis. Korean Journal of Chemical Engineering. 27, 324-327 (2010).
  62. Hermanowicz, P., Sarna, M., Burda, K., Gabryś, H. AtomicJ: An open source software for analysis of force curves. The Review of Scientific Instruments. 85 (6), 063703 (2014).
  63. Hermanowicz, P. . AtomicJ 2.3.1 User’s Manual. , (2021).
  64. Iwashita, M., et al. Comparative Analysis of Brain Stiffness Among Amniotes Using Glyoxal Fixation and Atomic Force Microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  65. Crichton, M. L., et al. The viscoelastic, hyperelastic and scale dependent behaviour of freshly excised individual skin layers. Biomaterials. 32 (20), 4670-4681 (2011).
  66. Puricelli, L., Galluzzi, M., Schulte, C., Podestà, A., Milani, P. Nanomechanical and topographical imaging of living cells by atomic force microscopy with colloidal probes. The Review of Scientific Instruments. 86 (3), 033705 (2015).
  67. Hermanowicz, P. Determination of Young’s modulus of samples of arbitrary thickness from force distance curves: Numerical investigations and simple approximate formulae. International Journal of Mechanical Sciences. 193, 106138 (2021).
  68. Han, R., Chen, J. A modified Sneddon model for the contact between conical indenters and spherical samples. Journal of Materials Research. 36, 1762-1771 (2021).

Tags

Liver StiffnessAtomic Force MicroscopyPolarization MicroscopyCollagenFibrogenesisLiver FibrosisParaformaldehydePBSAFMCantileverOptical Calibration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S., Hadraba, D., Jirouskova, M., Gregor, M. Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63974, doi:10.3791/63974 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image