質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価

1. 材料および溶液の調製 厳格な精製システムから得られた水中に、460 mM NaCl、10 mM KCl、10 mM CaCl2、22 mM MgCl2、26 mM MgSO4、および 10 mM HEPESを含む人工海水(ASW)を調製する。1 M NaOH または HCl を使用して pH を 7.8 に調整します。通常、1 L の ASW を準備し、使用時まで 14 °C で保存します。 10,000 U/mLのペニシリンG、10 μg/μLのストレプトマイシン、および10 μg/μLのゲンタマイシンを含むASW抗生物質溶液を調製し、-20°Cで保存する。 実験の直前に、凍結抗生物質原液を20〜40mLのASW中で1:100に解凍および希釈する。作動ASW溶液中の抗生物質の最終濃度は、100U/mLのペニシリンG、100μg/mLのストレプトマイシン、および100μg/mLのゲンタマイシンである。 1 サンプルあたり 10 μg/μL のウシ血清アルブミン、0.5 μL の 0.5 μg/μL のペントスタチン、0.495 μL の 2 U/μL アルカリホスファターゼ、1 μL の 0.1 U ホスホジエステラーゼ I (10 mM MgCl 2 中)、およびセラチア マルセッセンス (25 U) 由来のエンドヌクレアーゼ 0.38 μL を組み合わせて RNA 消化バッファーを調製します。複数のサンプルを分析する場合は、各試薬の体積に分析するサンプル数を掛け、ピペット移送ステップからの付随的な試薬損失を考慮して、さらに1つを加えた別のチューブにマスターミックスを準備します。 ニューロンを手動で分離するために、いくつかの鋭い針(ガラスまたは金属のいずれか)を準備します。30 のようにタングステン線の電気化学的エッチングによって社内で金属針を作るか、それらを購入してください。マイクロピペットプーラーを使用して、厚い壁または標準的な壁のホウケイ酸ガラス毛細血管(外径1mm)からガラス針を調製する。本方法では、針先の直径を1~5μm、ネック長を100~150μmに保ちます。注:金属針とガラス針の両方の製造は、研究者の個々のニーズと調査中の特定の生物学的モデルに合ったツールを製造するように最適化することができます。 2. 単一ニューロンの単離 0.33 M MgCl2溶液 を14°Cに冷却する。 50mLシリンジを用いて、MgCl2溶液を動物の体腔に注入することによって A. californica (150〜250g )を麻酔する。最良の結果は、溶液容量(mL)対動物の体重(g)の1:3の比で得られる。動物がリラックスするまで約3分間待って、触覚刺激に反応して身体の収縮が現れないようにします。 動物の腹側(足側)を解剖トレイの上に置きます。1つの鈍い先端を動物に向けて配置した外科用はさみを使用して動物を解剖し、慎重に足を縦方向に切り込みます。 動物の体の吻側、尾側、および側方をピン留めして、体腔内にある内臓およびCNS神経節を露出させる。神経および神経節に由来するいくつかの結合器を外科的に切断することによって、動物から主要なCNS神経節を単離する。 神経節を ストレプトマイセス・グリセウス 由来のプロテアーゼXIV型溶液(ASW抗生物質溶液で10mg/mL)に浸漬し、34°Cで30分または1時間(大脳神経節の場合)インキュベートする。注:孵卵の期間は、季節、動物の大きさおよび状態、ならびに標的ニューロンに依存する。一部のニューロンの単離は、他のニューロンよりも長いインキュベーションを必要とし、実験的に決定されるべきである。 ASW抗生物質溶液で神経節6xをすすぎ、約5mmの開口部に切断されたポリプロピレン転写ピペットを使用して、ASW抗生物質溶液で満たされたシリコーンポリマーコーティング皿にすべての神経節を移す。ASW中の1mg/mLのウシ血清アルブミンでピペットを処理し、ピペットへの神経節の固着を最小限に抑えます(オプション)。神経節は常にASWに沈めてください。注:酵素処理は、ニューロンおよび周囲の結合組織の機械的安定性を低下させ、その結果、神経節転移中の空気への曝露によりニューロン膜が損傷する可能性がある。 神経節をピン留めし、マイクロハサミと細かい鉗子を使って神経節の鞘を取り除きます。十分に強い酵素処理で、脱剥離のためにガラスまたは金属針を使用してください。 目的の A.カリフォルニカ ニューロンを視覚的に識別する。この研究では、腹部神経節のR2、胸膜神経節のLPl1、大脳神経節の中大脳細胞(MCC)、頬神経節のB2細胞の細胞を調べた。校正された顕微鏡を用いて、すべての神経および神経節調製物の光学画像を20倍の全倍率で撮影し、各細胞型のサイズおよび体積を決定する。 引っ張られたガラス毛細血管または鋭いタングステン針を使用して、同定された細胞をバルク神経節から慎重に隔離する。 プラスチックマイクロピペットに少量(1 μL)のASWを引き出し、単離した細胞を4 μLの0.365 M酢酸アンモニウム(pH 9.2)を含むPCRサンプルチューブに移します。ブランク測定の場合は、神経節を含むディッシュからASW抗生物質溶液の5μLアリコートを収集し、消化バッファー(後述)と混合します。 3. SNRMA-MSのための細胞溶解とRNA消化 吸引を繰り返し、0.365 M酢酸アンモニウム中のマイクロピペット(〜100 μm内径)で分配することによって、単離されたニューロンを溶解する。いくつかの小さな細胞はすぐに破裂しないかもしれません。それらを溶解するには、引っ張ったガラス毛細管でセルの直径全体に圧力をかけます。 サーマルサイクラーを使用して、次の温度プログラムでサンプルを加熱します:95°Cで3分間、10°Cで3分間保持します。 サンプルチューブをサーマルサイクラーから取り外します。 各サンプルに3.375 μLのRNA消化バッファーを加え、溶液を数回抜き取って分注することによって、マイクロピペットを使用して溶液を混合する。2700 x g のミニチュアベンチトップ遠心分離機を 30 秒間使用して、PCR チューブの壁に付着している液滴をスピンダウンします。 サンプルをサーマルサイクラーで37°Cで3時間インキュベートし、続いて10°Cで保持した(加熱蓋をONに設定)。サンプルを 10 °C に冷却した直後に、オートサンプラーチューブ内の気泡形成を避けるように注意しながら、7 μL の溶液を 250 μL のインサートを備えたオートサンプラーバイアルに移します。 4. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 メモ:エレクトロスプレーイオン化源と6ポートダイバータバルブを備えたLC-MS/MSシステムを使用して、シングルニューロンダイジェストと本物の修正ヌクレオシド規格を分析します。 正準ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドを分離するための LC システムを調製するには、C18 カラム (150 mm x 2.1 mm、粒子径 2.2 μm、細孔径 120 Å) を 99% 移動相 A (5 mM 酢酸アンモニウム、pH 5.6) および 1% 移動相 B (60/40 移動相 A/アセトニトリル (ACN)) で 0.2 mL/分の流速で 36 °C で 12 分間平衡化します。 移動相の調製にはLC-MSグレードの溶媒を使用してください。 LCが平衡化している間に、50/50 ACN/水中の酢酸ナトリウム1 mM溶液を5 μL/minの流量のシリンジポンプ を介して 質量分析計に導入して質量分析計を校正する。校正後、LCフローを質量分析計に再接続します。 次の線形勾配パラメータをプログラムする:0〜5分間の1%B、9分間の5%B、11分間の7%B、13分間の10%B、32分間の15%B、38分間の40%B、43分間の50%B、50分間の100%B、60分間の100%B、61分間の1%B、 次の注射の前に1%Bで12分間再平衡化した。 キャピラリー電圧を4,500 V、乾燥温度275 °C、N2 乾燥ガス5 L/min、噴霧ガス1バールのパラメータでMS機器をポジティブモードで操作します。ダイバータバルブを解析の最初の 2 分間は廃棄し、残りの実行はソースに設定します。 110-600の m / z 範囲にわたって質量スペクトルを収集します。データベース2 を使用して構築された好ましい質量リストと±0.5の単離ウィンドウを使用して、3秒のサイクルタイムにわたって35〜40eVで衝突誘発解離するイオンを選択する。アクティブ排除を使用して、3 つのスペクトル後のフラグメンテーションからイオンを除外します。 ダイナミックMS/MSスペクトル取得は、それぞれ4 Hzおよび1 Hzで50,000カウント以上および50,000カウント未満の強度を持つイオンについて、イオン選択の最小しきい値を1,990カウントに設定します。 定量的SNRMA-MSの場合、未知の内因性分析物濃度の補間を可能にするために、最小5濃度の修飾ヌクレオシド標準について得られた抽出イオンクロマトグラム(EIC)ピーク面積を使用して検量線を構築する。注:体重が150〜250gの動物から得られたニューロンは、通常、0.02pmol〜2pmolの範囲の修飾ヌクレオシドの検量線を必要としますが、これらの値は機器の感度によって異なる場合があります。 5. データ解析 修飾ヌクレオシドのEIC(データベース値2からm / z)を生成します。推定修飾ヌクレオシドの同一性を検証するには、MS2スペクトルおよびLC保持特性をデータベース値2と比較します。A. californicaの単一ニューロンで検出された典型的なRNA修飾のリストについては、表1を参照されたい。 修飾ヌクレオシドと正準ヌクレオシドに対応するピークを手動で統合し、これらの値をスプレッドシートに記録します。各修飾ヌクレオシドのピーク面積を、サンプルで検出された正準シチジン、ウリジン、およびグアノシンのピーク面積の合計で正規化します。注:アデノシンは、動的神経調節因子31としてのCNSにおけるその役割のために正規化には含まれない。 各単一ニューロンサンプルと、信号対雑音比>10を示した修飾ヌクレオシドの対応する正規化ピーク面積からなるデータ行列を構築する。主成分分析(PCA)を実行し、スコアプロットに最初の2つの主成分を表示します。ヌクレオシド標準物質の段階希釈から得られたEICピーク面積から線形検量線を作成し、検出された分析物の濃度を計算する。