JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

توصيف تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المفردة باستخدام مطياف الكتلة

Published: April 21, 2022
doi:
10.3791/63940
, ,
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology,University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Chemistry,University of Illinois Urbana-Champaign

Summary

تمثل التعديلات اللاحقة للنسخ للحمض النووي الريبي طبقة غير مدروسة من تنظيم الترجمة التي تم ربطها مؤخرا بمرونة الجهاز العصبي المركزي. هنا ، يتم وصف إعداد العينات ونهج قياس الطيف الكتلي الترادف الكروماتوغرافي السائل للتوصيف المتزامن للعديد من تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المفردة.

Abstract

تمثل التعديلات اللاحقة للنسخ (PTMs) للحمض النووي الريبي آلية غير مدروسة تشارك في تنظيم الترجمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). ربطت الأدلة الحديثة تعديلات الحمض النووي الريبي العصبية المحددة بنماذج التعلم والذاكرة. لسوء الحظ ، فإن الطرق التقليدية للكشف عن هذه الميزات فوق النسخ قادرة فقط على توصيف تعديلات الحمض النووي الريبي الوفيرة للغاية في الأنسجة السائبة ، مما يحول دون تقييم ملفات تعريف PTM الفريدة التي قد تكون موجودة للخلايا العصبية الفردية داخل الدوائر السلوكية المنشطة. في هذا البروتوكول ، يتم وصف نهج – تحليل تعديل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية العصبية بواسطة مطياف الكتلة (SNRMA-MS) – للكشف في وقت واحد عن العديد من الريبونوكليوسيدات المعدلة في الخلايا العصبية المفردة. يتم التحقق من صحة هذا النهج باستخدام الخلايا العصبية الفردية للرخويات البحرية ، Aplysia californica ، بدءا من العزل الجراحي والعلاج الإنزيمي لعقد الجهاز العصبي المركزي الرئيسية لفضح أجسام الخلايا العصبية العصبية ، تليها العزل اليدوي للخلية العصبية الواحدة باستخدام إبر حادة وماصة دقيقة. بعد ذلك ، تتم المعالجة الميكانيكية والحرارية للعينة في حجم صغير من المخزن المؤقت لتحرير الحمض النووي الريبي من خلية فردية لهضم الحمض النووي الريبي اللاحق. ثم يتم تحديد النيوكليوسيدات المعدلة وقياسها كميا باستخدام طريقة محسنة لقياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة. يتم استخدام SNRMA-MS لإنشاء أنماط تعديل الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية المفردة المحددة من A. californica التي لها مورفولوجيات ووظائف معروفة. يتم تقديم أمثلة على SNRMA-MS النوعي والكمي الذي يسلط الضوء على التوزيع غير المتجانس لتعديلات الحمض النووي الريبي عبر الخلايا العصبية الفردية في الشبكات العصبية.

Introduction

تم الاعتراف بشكل متزايد بالتعديلات في النيوكليوسيدات الأساسية للحمض النووي الريبي لأدوارها التي لا تعد ولا تحصى في تنظيم ترجمة البروتين. تم الإبلاغ عن أكثر من 150 تعديلا فريدا للحمض النووي الريبي حتى الآن تتراوح في التعقيد من المثيلة ، إضافة الذرة غير المتجانسة ، إلى الاقتران مع المستقلبات الخلوية 1,2. يتم إنشاء هذه الأبجدية الموسعة للحمض النووي الريبي ، والمعروفة أيضا باسم epitranscriptome ، بواسطة الكتاب الأنزيميين وهي مسؤولة عن تغيير الاستقرار3 ، والطي4 ، وكفاءة الترجمة 5,6 من الحمض النووي الريبي الخلوي. يمكن أيضا عكس تعديلات الحمض النووي الريبي المختارة عبر المحايات الأنزيمية7,8 ، في حين يتم إلحاق البعض الآخر بالحمض النووي الريبي substoichiometrically 9,10 ، مما يجعل المشهد المعقد لتسلسلات الحمض النووي الريبي المعدلة وغير المعدلة في النظم البيولوجية.

يشار إلى أهمية تعديلات الحمض النووي الريبي في الوظيفة البيولوجية من خلال التوزيع غير المتكافئ للتعديلات عبر الأعضاء والأنسجة المختلفة ، بما في ذلك المناطق دون الإقليمية للجهاز العصبي المركزي (CNS)11. تم ربط هذا التباين الكيميائي بتطوير الجهاز العصبي المركزي12 ، والاستجابة للإجهاد 13 ، واللدونة المعتمدة على النشاط14. وتضم المناطق دون الإقليمية للجهاز العصبي المركزي أيضا مجموعات غير متجانسة من الخلايا التي تظهر فيها الخلايا الفردية ملامح كيميائية متميزة15،16،17،18. حتى الخلايا المفردة من نفس النوع قد تعرض نسخا فريدة، ويرجع ذلك جزئيا إلى البيئات الدقيقة للأنسجة19 والتعبير الجيني العشوائي20. ومع ذلك ، في حين أن توصيف النسخ أحادي الخلية أمر روتيني إلى حد ما ، لا توجد طرق مماثلة لإنشاء نسخ أحادي الخلية لتعديلات الحمض النووي الريبي المتعددة. هناك حاجة إلى نهج جديدة قادرة على تحديد توزيع تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا الفردية لإجراء تحليل شامل لعدم التجانس الخلوي والتأثير التنظيمي لتعديلات ما بعد النسخ (PTMs) في الجهاز العصبي المركزي والأنظمة البيولوجية الأخرى.

يتم بسهولة إنجاز القياس المتزامن للعديد من تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا / الأنسجة السائبة باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل-الترادف (LC-MS/MS). لتحليل LC-MS/MS للريبونوكليوسيدات المعدلة، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا (عادة 103-10 6 خلايا)، ويتم تنقيته عن طريق هطول الأمطار وإعادة التعليق، ويتم هضمه لاحقا إلى نيوكليوسيدات. ثم يتم حقن خليط العينة المكون من النيوكليوسيدات الأساسية والمعدلة في نظام LC-MS لتحليل الفصل والكشف ، مما يؤدي إلى تحديد المكمل الكامل لتعديلات الحمض النووي الريبي في كائن حي 21،22،23. تم استخدام LC-MS / MS مؤخرا لتحديد 26 تعديلا للحمض النووي الريبي في الجهاز العصبي المركزي للنموذج العصبي البيولوجي ، Aplysia californica (A. californica). أظهرت وفرة بعض هذه العلامات epitranscriptomic ديناميكيات تعتمد على الوقت والمنطقة والتي ترتبط بالتغيرات السلوكية في الحيوان24. ومع ذلك ، كان من الممكن فقط اكتشاف تعديلات الحمض النووي الريبي في العينات السائبة التي تحتوي على خلايا >103 بسبب الحساسية المحدودة للطريقة. من المحتمل أن تكون هذه العينات الأكبر حجما قد أخفت ملامح فريدة ومهمة وظيفيا لتعديل الحمض النووي الريبي للخلايا الفردية ذات المتوسطات السكانية. على الرغم من أن التحكم الدقيق في ظروف إعداد العينات قد حسن حدود الكشف عن تعديلات الحمض النووي الريبي في العينات صغيرة الحجم25،26،27،28 ، إلا أنه لا تزال هناك حاجة إلى طرق تحليلية يمكنها اكتشاف وتحديد كمية الريبونوكليوسيدات المعدلة المتعددة في الخلايا المفردة.

يقدم هذا البروتوكول تحليل تعديل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية العصبية بواسطة قياس الطيف الكتلي (SNRMA-MS) ، والذي يسمح باكتشاف أكثر من اثني عشر تعديلا للحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المفردة من الجهاز العصبي المركزي ل A. californica29. يتكون النهج من العزل الجراحي للخلايا المفردة المحددة من العقد الرئيسية للجهاز العصبي المركزي تليها سير عمل محسن لإعداد العينات يتضمن تحلل الخلايا الميكانيكية ، وتمسخ الحمض النووي الريبي ، والتحلل المائي الإنزيمي في مخزن مؤقت متوافق مع MS. ثم يتم تحديد وقياس كمية النيوكليوسيدات المعدلة بعد النسخ باستخدام LC-MS/MS. SNRMA-MS يلبي حاجة غير ملباة في مجال تحليل تعديل الحمض النووي الريبي من خلال تسهيل الحصول على ملفات تعريف تعديل الحمض النووي الريبي بعد النسخ للخلايا العصبية المفردة ولديه إمكانية التطبيق المستقبلي على أنواع الخلايا الأخرى.

Protocol

1. إعداد المواد والحلول تحضير مياه البحر الاصطناعية (ASW) مع 460 mM NaCl ، 10 mM KCl ، 10 mM CaCl 2 ، 22 mM MgCl2 ، 26 mM MgSO 4 ، و 10 mM HEPES في المياه التي تم الحصول عليها من نظام تنقية صارم. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 باستخدام 1 M NaOH أو HCl. عادة ، قم بإعداد 1 لتر من ASW وخزنه على درجة حرارة 14 درجة مئوية حتى الاستخدام. قم بإعداد محلول مضاد للمضادات الحيوية ASW يحتوي على 10000 U / mL من البنسلين G و 10 ميكروغرام / ميكرولتر من الستربتومايسين و 10 ميكروغرام / ميكرولتر من الجنتاميسين وتخزينها عند -20 درجة مئوية. مباشرة قبل التجربة ، قم بإذابة وتخفيف محلول مخزون المضادات الحيوية المجمدة 1:100 في 20-40 مل من ASW. التركيز النهائي للمضادات الحيوية في محلول ASW العامل هو 100 U / mL من البنسلين G ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 100 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. قم بإعداد مخزن مؤقت لهضم الحمض النووي الريبي عن طريق الجمع بين 1 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / ميكرولتر من ألبومين المصل البقري ، و 0.5 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر من البنتوستاتين ، و 0.495 ميكرولتر من 2 U / μL من الفوسفاتيز القلوي ، و 1 ميكرولتر من 0.1 U phosphodiesterase I (في 10 mM MgCl2) ، و 0.38 ميكرولتر من endonuclease من Serratia marcescens (25 U) لكل عينة. في حالة تحليل عينات متعددة، قم بإعداد مزيج رئيسي في أنبوب منفصل يحتوي على حجم كل كاشف مضروبا في عدد العينات المراد تحليلها، بالإضافة إلى واحد آخر لحساب فقدان الكاشف العرضي من خطوات نقل الماصة. قم بإعداد العديد من الإبر الحادة (إما الزجاجية أو المعدنية) للعزل اليدوي للخلايا العصبية. اصنع إبر معدنية في المنزل عن طريق الحفر الكهروكيميائي لأسلاك التنغستن كما هو الحال في30 أو شرائها. قم بإعداد إبر زجاجية من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات السميكة أو القياسية (القطر الخارجي 1 مم) باستخدام مجتذب ماصة دقيقة. بالنسبة للطريقة الحالية ، حافظ على قطر طرف الإبرة بين 1-5 ميكرومتر ، بطول عنق يتراوح بين 100-150 ميكرومتر.ملاحظة: يمكن تحسين تصنيع كل من الإبر المعدنية والزجاجية لإنتاج أدوات تناسب الاحتياجات الفردية للباحث والنموذج البيولوجي المحدد الذي يتم التحقيق فيه. 2. عزل خلية عصبية واحدة قم بتبريد محلول 0.33 M MgCl2 إلى 14 درجة مئوية. باستخدام حقنة 50 مل ، قم بتخدير A. californica (150-250 جم) عن طريق حقن محلول MgCl2 في تجويف جسم الحيوان. يتم الحصول على أفضل النتائج بنسبة 1: 3 من حجم المحلول (مل) إلى كتلة جسم الحيوان (جم). انتظر حوالي 3 دقائق حتى يصبح الحيوان مسترخيا ، مع التأكد من أنه لا يعرض تقلصات الجسم استجابة للتحفيز عن طريق اللمس. ضع الجانب البطني للحيوان (جانب القدم) لأعلى في صينية تشريح. تشريح الحيوان باستخدام مقص جراحي مع طرف حاد واحد وضع نحو الحيوان ، مما يجعل بعناية قطع طولي من خلال القدم. قم بتثبيت الجوانب السطحية والذيلية والجانبية لجسم الحيوان لفضح الأعضاء الداخلية والعقد المركزية الموجودة في تجويف الجسم. عزل العقد المركزية الرئيسية عن الحيوان عن طريق قطع الأعصاب جراحيا وبعض الروابط الناشئة عن العقد. اغمر العقد في محلول من النوع الرابع عشر من البروتياز من Streptomyces griseus (10 ملغ / مل في محلول المضادات الحيوية ASW) واحتضنها عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو 1 ساعة (للعقدة الدماغية).ملاحظة: تعتمد مدة الحضانة على الموسم وحجم الحيوان وحالته ، بالإضافة إلى الخلايا العصبية المستهدفة. يتطلب عزل بعض الخلايا العصبية حضانة أطول من غيرها ويجب تحديده تجريبيا. شطف العقد 6x بمحلول ASW-antibiotics ونقل جميع العقد إلى طبق مغطى بالبوليمر السيليكوني مملوء بمحلول ASW-antibiotics باستخدام ماصة نقل البولي بروبيلين التي تم قطعها إلى فتحة ~ 5 مم. عالج الماصة ب 1 ملغم / مل من ألبومين مصل البقر في ASW لتقليل التصاق العقد بالماصة (اختياري). الحفاظ على العقد مغمورة في ASW في جميع الأوقات.ملاحظة: يقلل العلاج الإنزيمي من الاستقرار الميكانيكي للخلايا العصبية والنسيج الضام المحيط بها، ونتيجة لذلك، يمكن أن تتلف الأغشية العصبية بسبب التعرض للهواء أثناء نقل العقدة. قم بتثبيت العقد واستخدم المقص الدقيق والملقط الناعم لإزالة أغماد العقدة. مع العلاج الأنزيمي القوي بما فيه الكفاية ، استخدم إبر زجاجية أو معدنية لإزالة الغمد. تحديد بصريا الخلايا العصبية A. californica ذات الاهتمام. في هذا العمل ، تمت دراسة الخلايا التالية: R2 في العقدة البطنية ، LPl1 في العقدة الجنبية ، الخلايا فوق الدماغية (MCCs) في العقدة الدماغية ، والخلايا B2 في العقدة الشدقية. التقط صورا بصرية لجميع المستحضرات العصبية والعقدية باستخدام مجهر معاير عند تكبير إجمالي 20x لتحديد أحجام وأحجام كل نوع من الخلايا. باستخدام إبر تنغستن زجاجية مسحوبة أو إبر تنغستن حادة ، اعزل الخلية المحددة بعناية عن العقدة السائبة. اسحب كمية صغيرة (1 ميكرولتر) من ASW إلى ماصة بلاستيكية ، ثم انقل الخلية المعزولة إلى أنبوب عينة PCR يحتوي على 4 ميكرولتر من 0.365 M من خلات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 9.2). للحصول على قياسات فارغة ، اجمع 5 ميكرولتر من محلول ASW-antibiotics من الطبق الذي يحتوي على العقدة واخلطه مع مخزن الهضم العازل (الموضح أدناه). 3. تحلل الخلايا وهضم الحمض النووي الريبي ل SNRMA-MS قم بتحليل الخلايا العصبية المعزولة عن طريق الشفط المتكرر والاستغناء عن ماصة دقيقة (~ 100 ميكرومتر قطرها الداخلي) في 0.365 M من خلات الأمونيوم. بعض الخلايا الصغيرة قد لا تتمزق على الفور. لتحليلها ، قم بالضغط عبر قطر الخلية باستخدام شعيرات شعرية زجاجية مسحوبة. استخدم جهاز تدوير حراري لتسخين العينات باستخدام برنامج درجة الحرارة التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، 10 درجات مئوية لمدة 3 دقائق ، مع الاستمرار عند 10 درجات مئوية. قم بإزالة أنبوب العينة من جهاز التدوير الحراري. أضف 3.375 ميكرولتر من مخزن هضم الحمض النووي الريبي لكل عينة واخلط المحلول باستخدام ماصة دقيقة عن طريق سحب المحلول وتوزيعه عدة مرات. استخدم جهاز طرد مركزي مصغر على الطاولة عند 2700 × g لمدة 30 ثانية لتدوير أي قطرات سائلة تتشبث بجدران أنبوب PCR. احتضن العينات في جهاز الدوران الحراري عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، متبوعا بتعليق عند 10 درجات مئوية (يتم ضبط الغطاء المسخن على ON). مباشرة بعد أن تبرد العينة إلى 10 درجات مئوية ، انقل 7 ميكرولتر من المحلول إلى قارورة أخذ عينات تلقائية مجهزة بإدراج 250 ميكرولتر ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعة في أنبوب أخذ العينات التلقائي. 4. الكروماتوغرافيا السائلة – قياس الطيف الكتلي الترادف ملاحظة: قم بتحليل هضمات الخلايا العصبية المفردة ومعايير النيوكليوزيد المعدلة الأصلية باستخدام نظام LC-MS/MS المجهز بمصدر تأين بالرش الكهربائي وصمام تحويل سداسي المنافذ. لإعداد نظام LC لفصل النيوكليوسيدات الأساسية والمعدلة، قم بموازنة عمود C18 (150 مم × 2.1 مم، حجم الجسيمات 2.2 ميكرومتر، قطر المسام 120 Å) مع 99٪ من المرحلة المتنقلة A (5 mM من خلات الأمونيوم، الرقم الهيدروجيني 5.6) و 1٪ المرحلة المتنقلة B (60/40 المرحلة المتنقلة A/acetonitrile (ACN)) بمعدل تدفق قدره 0.2 ملليلتر/دقيقة لمدة 12 دقيقة عند 36 درجة مئوية. استخدم مذيبات درجة LC-MS لإعداد المراحل المتنقلة. بينما يتوازن LC ، قم بمعايرة مطياف الكتلة عن طريق إدخال محلول 1 mM من خلات الصوديوم في 50/50 ACN / water إلى مطياف الكتلة عبر مضخة حقنة بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة. بعد المعايرة، أعد توصيل تدفق LC بمطياف الكتلة. برمجة معلمات التدرج الخطي التالية: 1٪ B لمدة 0-5 دقائق ، 5٪ B في 9 دقائق ، 7٪ B في 11 دقيقة ، 10٪ B في 13 دقيقة ، 15٪ B في 32 دقيقة ، 40٪ B في 38 دقيقة ، 50٪ B في 43 دقيقة ، 100٪ B في 50 دقيقة ، 100٪ B في 60 دقيقة ، 1٪ B في 61 دقيقة ، وإعادة التوازن لمدة 12 دقيقة عند 1٪ B قبل الحقن التالي. قم بتشغيل جهاز MS في الوضع الإيجابي باستخدام المعلمات التالية: الجهد الشعري مضبوط على 4500 فولت ، ودرجة حرارة التجفيف 275 درجة مئوية ، وغاز التجفيف N2 5 لتر / دقيقة ، وغاز الرذاذ 1 بار. اضبط صمام المحول على النفايات لأول 2 دقيقة من التحليل والمصدر لبقية الجري. اجمع أطياف الكتلة على مدى m/z من 110-600. حدد الأيونات للتفكك الناجم عن الاصطدام عند 35-40 eV على مدى 3 ثانية من وقت الدورة باستخدام قائمة كتلة مفضلة تم إنشاؤها باستخدام قاعدة البيانات2 ونافذة عزل ± 0.5. استخدم الاستبعاد النشط لاستبعاد الأيونات من التجزئة بعد ثلاثة أطياف. قم بتعيين اكتساب أطياف MS/MS الديناميكية للأيونات ذات الكثافة التي تزيد عن 50000 وتقل عن 50000 عدد عند 4 هرتز و 1 هرتز على التوالي ، والحد الأدنى لاختيار الأيونات عند 1990 عددا. بالنسبة ل SNRMA-MS الكمي ، قم ببناء منحنيات المعايرة باستخدام مناطق ذروة كروماتوغرام الأيونات المستخرجة (EIC) التي تم الحصول عليها لمعايير النيوكليوزيد المعدلة بحد أدنى خمسة تركيزات للسماح باستيفاء تركيزات التحليل الداخلي غير المعروفة.ملاحظة: تتطلب الخلايا العصبية التي يتم الحصول عليها من الحيوانات ذات كتل الجسم من 150-250 جم عادة منحنيات معايرة للنيوكليوسيدات المعدلة التي تتراوح من 0.02 pmol إلى 2 pmol ، ولكن قد تختلف هذه القيم اعتمادا على حساسية الأداة. 5. تحليل البيانات إنشاء EICs للنيوكليوسيدات المعدلة (m/z من قيم قاعدة البيانات2). تحقق من هويات النيوكليوسيدات المعدلة المفترضة عن طريق مقارنة أطياف MS2 وخصائص الاحتفاظ LC الخاصة بها بقيم قاعدة البيانات2. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بتعديلات الحمض النووي الريبي النموذجية المكتشفة في الخلايا العصبية المفردة من A. californica. دمج القمم التي تتوافق مع النيوكليوسيدات المعدلة والأساسية يدويا وتسجيل هذه القيم في جدول بيانات. تطبيع منطقة الذروة لكل نيوكليوسيد معدل مع مجموع مناطق الذروة للسيتيدين الكنسي واليوريدين والجوانوزين المكتشف في العينة.ملاحظة: لم يتم تضمين الأدينوسين في التطبيع بسبب دوره في الجهاز العصبي المركزي كمغير عصبي ديناميكي31. بناء مصفوفة بيانات تتكون من كل عينة من الخلايا العصبية المفردة ومناطق الذروة الطبيعية المقابلة للنيوكليوسيدات المعدلة التي أظهرت نسب الإشارة إلى الضوضاء >10. قم بإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) وعرض أول مكونين رئيسيين في مخطط النتيجة. بناء منحنيات المعايرة الخطية من مناطق ذروة EIC التي تم الحصول عليها من التخفيف التسلسلي لمعايير النيوكليوزيد وحساب تركيزات التحليلات المكتشفة.

Representative Results

يتضمن SNRMA-MS العزل اليدوي للخلايا العصبية المحددة في أحجام عينات صغيرة للتحلل والهضم وتحليل LC-MS / MS (الشكل 1A). اكتشف سير العمل هذا بشكل روتيني أكثر من اثني عشر تعديلا للحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المفردة من الجهاز العصبي المركزي ل A. californica (الشكل 1B) ، وهو ما يمثل تغطية لما يقرب من نصف النسخ الفوقي المعروف لهذا الحيوان24 في خلية واحدة. على سبيل المثال ، أدى إخضاع الخلية العصبية LPl1 (قطرها ~ 500 ميكرومتر) إلى SNRMA-MS إلى اكتشاف 15 ± 1 تعديلات RNA (n = 3). تم تحديد النيوكليوسيدات المعدلة بشكل إيجابي على أساس ثلاث سمات: خصائص الاحتفاظ ب LC ، والكتلة الدقيقة ، وملفات تعريف تجزئة MS2 مقارنة بالقيم المقدمة في قاعدة البيانات2. يوضح الجدول 1 قائمة بجميع تعديلات الحمض النووي الريبي المكتشفة في الخلايا العصبية LPl1. مكن مطياف الكتلة الرباعي عالي الدقة المستخدم في هذه التجارب من دقة كتلة تبلغ 4 جزء في المليون بالإضافة إلى اكتشاف أيون شظايا MS2 المميز عند m /z 164 للنيوكليوسيد المعدل N6,6-dimethyladenosine (m66A، الشكل 1B). وبالاقتران مع بيانات فصل LC ، التي تتفق مع النتائج المودعة في قاعدة البيانات (m66A elutes بعد N6-methyladenosine (m6A)) ، أظهر نهج SNRMA-MS التعيين الصحيح لهويات النيوكليوزيد المعدلة. يمكن الاستفادة من منصة SNRMA-MS لإنشاء ملفات تعريف تعديل الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية المفردة والتحقيق في علاقتها بالأنسجة السائبة. الخلايا العصبية R2 هي خلايا كولينية كبيرة (قطرها ~ 500 ميكرومتر) موجودة في العقدة البطنية. تم استخدام SNRMA-MS لتحليل تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية R2 وكذلك العقدة البطنية السائبة المحيطة بها (الشكل 2A). تم استخدام مناطق الذروة الطبيعية لتعديلات الحمض النووي الريبي في كل عينة عصبية / عقدة (n = 7) كمدخلات ل PCA ، مما يكشف عن أن الخلايا العصبية R2 تظهر ملامح متميزة لتعديل الحمض النووي الريبي مقارنة بالعقد التي تعيش فيها (الشكل 2B). ويتضح ذلك من خلال نقاط البيانات للخلايا العصبية R2 والعقد البطنية التي تحتل مناطق مختلفة من مخطط درجة PCA. تم الحصول على مزيد من الدعم لأنماط النيوكليوزيد المعدلة الفريدة من نوعها من مجموعة منفصلة من الحيوانات (n = 7) حيث تم إجراء مقارنات زوجية ل 13 تعديلا للحمض النووي الريبي تم اكتشافها بشكل شائع في كل من الخلايا العصبية المفردة والأنسجة السائبة (الشكل 2C). كان اثنان من النيوكليوسيدات المعدلة ، السودويوريدين (Ψ) و 2′-O-methylguanosine (Gm) ، بوفرة أعلى بكثير في العقد البطنية مقارنة بالخلايا العصبية R2. عند عرض مجموعة فرعية من تعديلات الحمض النووي الريبي مع أزواج العقدة العصبية R2 المشار إليها ، أظهرت جميع العقد البطنية مستويات أعلى من Ψ و GM ، وكان لدى جميع الخلايا العصبية R2 باستثناء واحدة وفرة أعلى من 2′-O-methyladenosine (Am) من العقدة المقابلة لها (الشكل 2D). بشكل عام ، تكشف نتائج SNRMA-MS لأول مرة أن ملفات تعريف تعديل الحمض النووي الريبي للخلايا المفردة يمكن أن تتباعد عن الخلايا السائبة في نفس الأنسجة. يوفر استخدام SNRMA-MS للتحقيق في الحيوان النموذجي A. californica فرصة فريدة لتوصيف ملامح تعديل الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المحددة والمتميزة وظيفيا. تم تقييم تعديلات الحمض النووي الريبي بواسطة SNRMA-MS في أربع خلايا محددة: R2 و LPl1 (الخلايا الكولينية المتماثلة المشاركة في الإطلاق المخاطي الدفاعي)32 ، MCCs (الخلايا العصبية المعدلة السيروتونينية المشاركة في التغذية) 33 ، والخلايا B2 (الخلايا العصبية الببتيديرية المشاركة في حركية الأمعاء)34. أظهر PCA من ستة تعديلات الحمض النووي الريبي في هذه الخلايا العصبية المحددة ، إما معزولة مباشرة بعد العلاج الأنزيمي أو مستزرعة في إعداد العقدة لمدة 48 ساعة ، استقرار وديناميكيات النسخ المتماثل أحادي الخلية. شكلت تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا المختلفة وظيفيا مجموعات فريدة في مخطط النتيجة بينما تجمعت الخلايا العصبية R2 / LPl1 المتماثلة (الشكل 3A). ويبين مخطط التحميل أن الاختلافات كانت مدفوعة في المقام الأول بوفرة الأيزومرات الموضعية لميثيل أدينوزين، بما في ذلك 2′-O-methyladenosine (Am) و N1-methyladenosine (m1A) (الشكل 3B). وفي التحليل نفسه، أجريت مقارنة بين الخلايا المعزولة حديثا والخلايا المستزرعة في الموقع (أي في العقد الخاصة بكل منها) لمدة 48 ساعة. كما هو موضح في مخطط درجة PCA ، ظلت الخلايا المختلفة وظيفيا قابلة للتمييز من خلال ملفات تعريف تعديل الحمض النووي الريبي الخاصة بها. يمكن استخدام SNRMA-MS الكمي لتحديد الكميات المطلقة من تعديلات الحمض النووي الريبي المحددة التي تتوفر لها معايير أصلية. تم إنشاء منحنيات المعايرة الخارجية ل m1A و Ψ و 2′-O-methylcytidine (Cm) و AM و m6A ، وتم تحديد كمية كل نيوكليوسيد معدل في أزواج خلايا MCC و R2 / LPl1 عن طريق الاستيفاء (الشكل 4A-E). وبدت الكميات داخل الخلايا من m1A و Ψ في زوجين من MCCs المتماثلة متشابهة ، في حين لوحظت اختلافات أكبر في كميات هذه التعديلات في ثلاثة أزواج من خلايا R2 / LPl1. من أجل حساب الاختلافات بسبب الحجم المادي للخلايا التي تمت دراستها ، تم تطبيع كميات تعديل الحمض النووي الريبي بواسطة أحجام الخلايا المحسوبة من القياس البصري لأقطار الخلايا لإنتاج تركيزات داخل الخلايا من النيوكليوسيدات المعدلة. لوحظت اختلافات معنوية في تركيزات Cm و Am داخل الخلايا بين MCCs والخلايا العصبية R2 / LPl1. بشكل عام ، يتيح SNRMA-MS التنميط النوعي والكمي لتعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المفردة. الشكل 1: سير عمل SNRMA-MS والكشف عن تعديلات الحمض النووي الريبي المتعددة في الخلايا العصبية المفردة بواسطة LC-MS/MS . (أ) صور فوتوغرافية للعقدة الشدقية المغلفة وعزل الخلايا العصبية المفردة في أنبوب عينة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر ، تشير الأسهم إلى خلية B1 المحددة. كما يظهر رسم تخطيطي لإجراء إعداد العينة لتحليل LC-MS/MS. (ب) EICs المتراكبة لتعديلات الحمض النووي الريبي في خلية عصبية LPl1 واحدة ، مع تضمين يظهر أطياف MS1 و MS2 ل N6 ، N6-dimethyladenosine (m66A). انظر الجدول 1 للاطلاع على قيم m/z المستخدمة لإنشاء EICs للنيوكليوسيدات المعدلة. وقد عدل هذا الرقم من29. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: SNRMA-MS يميز ملامح تعديل الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية المفردة والأنسجة السائبة. (أ) مخطط A. californica CNS وسير العمل لتحليل الخلايا العصبية R2 والعقدة البطنية المحيطة. تظهر الصورة العقدة البطنية والخلايا العصبية R2 (التي يتم حقنها بصبغة خضراء سريعة للرؤية). (ب) استخدمت مناطق الذروة النسبية من 13 تعديلا للحمض النووي الريبي لتوليد نقاط PCA (أعلى) وتحميل (أسفل) قطع الأراضي. (ج) مقارنة زوجية لتعديلات الحمض النووي الريبي في العقدة البطنية والخلايا العصبية R2. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ±1 (SD) ، * p < 0.05 ، ***p < 5 × 10−4 ، اختبار t المقترن مع تصحيح Bonferroni−Holm. (د) مقارنة بين تعديلات مختارة من الحمض النووي الريبي من اللوحة C التي تظهر فيها أزواج العقدة البطنية R2 لكل مع خطوط قطرة. وقد عدل هذا الرقم من29. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تنميط تعديلات الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المحددة والمختلفة وظيفيا من مخطط درجة A. californica CNS . (A) PCA ل MCCs ، وخلايا B2 و R2 و LPl1 التي كانت إما معزولة حديثا أو معزولة بعد الثقافة في الموقع لمدة 48 ساعة (يشار إليها ب cMCC و cB2 و cR2 و cLPl1) و (B) مخططات تحميل لستة تعديلات RNA يتم اكتشافها عادة في هذه الخلايا. وقد عدل هذا الرقم من29. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: SNRMA-MS الكمي في الخلايا العصبية A. californica. يوفر SNRMA-MS الكمي كميات مطلقة وتركيزات داخل الخلايا للعديد من النيوكليوسيدات المعدلة في الخلايا العصبية A. californica المفردة المحددة. صور فوتوغرافية ل (A) MCCs اليسرى واليمنى (LMCC و RMCC ، على التوالي) في العقدة الدماغية و (B) R2 في العقدة البطنية و LPl1 في العقدة الجنبية. يتم وضع دائرة حول الخلايا لتعزيز الرؤية. مخططات المعايرة الخطية ل (C) m1A و (D) Ψ (المثلثات) المستخدمة لاستيفاء كميات النيوكليوسيدات المعدلة في الخلايا المفردة (النقاط الملونة). يتم تصنيف أزواج الخلايا من كل 1-3. (ه) تركيزات داخل الخلايا لخمسة نيوكليوسيدات معدلة في أزواج خلايا MCC و R2/LPl1. خطوط سميكة تربط أزواج الخلايا. * p < 0.05 ، ** p < 0.005 ، اختبار t المقترن مع تصحيح Bonferroni−Holm ، n = حيوانان (إجمالي أربع خلايا) ل MCCs و n = 3 (إجمالي ست خلايا) ل R2 / LPl1. وقد عدل هذا الرقم من29. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تعديل الحمض النووي الريبي اختصار ترتيب الإزالة (C18) م / ض ل EIC م / ض ل MS2 ديهيدرو ريدين D 1 247.09 115 السودويوريدين Y 2 245.08 209/179/155 3-ميثيل سيتيدين m3C 3 258.11 126 N1-ميثيل أدينوسين m1A 4 282.12 150 5-ميثيل سيتيدين m5C 5 258.11 126 N7-ميثيل غوانوزين m7G 6 298.12 166 2′-O-ميثيل سيتيدين سم 7 258.11 112 اينوزين I6A 8 269.09 137 2′-O-ميثيل غوانوزين الاليه العالميه 9 298.12 152 N2-ميثيل غوانوزين m2G 10 298.12 166 N2، N2، N7-ثلاثي ميثيل غوانوزين m227G 11 326.15 194 N2,N2,-ثنائي ميثيل غوانوزين m22G 12 312.13 180 2′-O-ميثيل أدينوسين ص 13 282.12 136 N6-ميثيل أدينوسين m6A 14 282.12 150 N6,N6-ثنائي ميثيل أدينوسين m66A 15 296.14 164 N6-إيزوبينتينيلادينوسين i6A 16 336.17 204/136/148 الجدول 1: تعديلات الحمض النووي الريبي المكتشفة في الخلايا العصبية المفردة من A. californica. يتم توفير سمات لتوصيف النيوكليوسيدات المعدلة بما في ذلك أمر الاحتفاظ LC ، m / z لتوليد EICs ، وشظايا CID المقابلة.

Discussion

تستفيد SNRMA-MS من نهج إعداد العينات المحسن، مما ينتج عنه حجم عينة صغير متوافق مع MS يمكن تسليمه إلى النظام الأساسي LC-MS. تملي المعالجة المسبقة الأنزيمية الأولية لعقد الجهاز العصبي المركزي كلا من السهولة التي يمكن بها تفكيكها ومتانة الخلايا العصبية المفردة أثناء العزلة. غالبا ما تتطلب العقدة الدماغية علاجا إنزيميا ممتدا بسبب غمدها السميك نسبيا مقارنة بالعقد البوكالية والجنبية والبطنية. قد يكون لدى الباحثين الفرديين الذين يقومون بعزل الخلايا العصبية المفردة تفضيلات مختلفة لمدى متانة الغمد عند استخدام المقص الدقيق والملقط الدقيق. ومع ذلك ، من المهم ألا يتم الإفراط في هضم العقد ، لأن هذا قد يؤدي إلى فقدان سلامتها الهيكلية ، وفقدان المعلومات الموضعية التي تعتبر حاسمة لتحديد الخلايا المستهدفة ، و / أو تحلل الخلايا. بعد العزل عن العقدة ، من المهم التأكد من أن الحد الأدنى من حجم وسط العزل يتم شفطه عند نقل الخلايا العصبية إلى أنبوب العينة. يحتوي وسط ASW على تركيز عال من الأملاح التي قد تتداخل مع الإنزيمات الهضمية أثناء التحلل المائي للحمض النووي الريبي وستخفف العينة أيضا.

أثناء خطوة التحلل الميكانيكي ، من الشائع أن تتمزق الخلايا العصبية الكبيرة (قطرها >250 ميكرومتر) عند المرور المتكرر عبر ماصة دقيقة. قد تتطلب الخلايا العصبية الأصغر اهتماما إضافيا لضمان تحلل الخلية، والذي يتضمن عادة الضغط على شعيرات دموية زجاجية على الخلية. في هذه الحالة ، من الممكن أن يتم سحب حجم جزئي من المخزن المؤقت للعينة إلى الشعيرات الدموية بسبب القوى الشعرية. يمكن توصيل هذا الحجم مرة أخرى إلى أنبوب العينة عن طريق الضغط على نهاية الشعيرات الدموية الزجاجية لضمان عدم فقدان أي عينة.

يتم الحصول على أفضل النتائج عن طريق تضمين خطوة تسخين قبل إضافة إنزيمات لهضم الحمض النووي الريبي. ويرجع ذلك على الأرجح إلى أن التسخين عند 95 درجة مئوية يشوه الهياكل الثانوية للحمض النووي الريبي التي قد تعيق نشاط RNases35 وتقلل من كمية النيوكليوسيدات المنبعثة من البوليمرات الحيوية للحمض النووي الريبي. وقد أجريت سابقا تجارب تحكم باستخدام عينات تم رفعها باستخدام ميثيونين يحمل نظائر مستقرة للتحقق مما إذا كانت القطع الأثرية المعدلة للحمض النووي الريبي الناجم عن الحرارة هي السبب في زيادة مناطق الذروة التي لوحظت لتعديلات الحمض النووي الريبي بالنسبة لبروتوكول SNRMA-MS29 بدون حرارة. ولم يلاحظ أي وسم من هذا القبيل، مما يشير إلى أن الإشارات المحسنة لتعديلات الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة SNRMA-MS المحسنة كانت بسبب الهضم المتفوق للحمض النووي الريبي.

تتضمن الطرق التقليدية لعزل الحمض النووي الريبي الكلي عن الخلايا استخراج السائل السائل (LLE) مع الفينول كلوروفورم وترسب الحمض النووي الريبي اللاحق والغسيل وإعادة التعليق. وقد أثبتت هذه الأساليب فائدتها لتجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي حيث يمكن مراقبة التعبير عن جينات مختارة بسهولة في الخلايا العصبية A. californica المحددة36,37. ومع ذلك ، لا يمكن لطرق LLE استرداد ما يكفي من الحمض النووي الريبي للكشف عن الريبونوكليوسيدات المعدلة بواسطة LC-MS ، في حين أن طريقة SNRMA-MS الموضحة هنا تمكن من اكتشاف العديد من تعديلات الحمض النووي الريبي29. من أجل تقييم ملامح التعديل لأنواع محددة من الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، rRNA ، tRNA ، mRNA) في عينات الأنسجة / الخلايا السائبة ، واستخراج الطور الصلب لتبادل الأنيون24 ، والتخصيب القائم على مسبار التهجين38 ، والتجزئة الكروماتوغرافية39 ، تم تطبيق نهج ، ولكن طرق مماثلة ليست متاحة بعد لتنقية الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. إن تطوير نهج تجزئة الحمض النووي الريبي القادرة على عزل أنواع محددة من الحمض النووي الريبي من الخلايا المفردة من شأنه أن يوفر رؤية إضافية نحو وظيفة تعديلات الحمض النووي الريبي.

كشف SNRMA-MS عن عدم تجانس غير مميز سابقا في مشهد تعديل الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية المفردة في A. californica ، ومن المتصور وجود ملفات تعريف PTM متميزة بشكل مماثل عبر خلايا الثدييات. نظرا لأن خلايا الثدييات صغيرة نسبيا مقارنة بالخلايا العصبية الكبيرة A. californica التي تم تحليلها في هذا البروتوكول ، فهناك حاجة إلى تحسينات في التعامل مع أحجام العينات الصغيرة لتسهيل حدود الكشف المنخفضة. على الرغم من أن SNRMA-MS يقتصر حاليا على أحجام ~ 5 ميكرولتر ، فمن المتوقع أن يتم تحقيق تحسينات كبيرة من خلال دمج أجهزة مناولة السوائل الدقيقة في سير العمل. وعلاوة على ذلك، فإن تنفيذ عمليات عزل الخلايا الآلية أو شبه الآلية من شأنه أن يزيد من إنتاجية العينات ويسمح بتحليل تعديل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لمجموعات أكبر من الخلايا. من خلال التفاعل مع فواصل LC ذات التدفق النانوي27 ، سيكون من الممكن تحقيق توصيف علامات النسخ فوق النسخ في الخلايا الأصغر.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد مول هذا العمل المعهد الوطني المعني بإساءة استعمال المخدرات بموجب الجائزة رقم P30DA018310 والمعهد الوطني لبحوث الجينوم البشري تحت رقم الجائزة. RM1HG010023. تعترف K.D.C. بالدعم المقدم من زمالة ما بعد الدكتوراه في معهد بيكمان. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لوكالات التمويل.

Materials

Animals
Aplysia californica National Resource for Aplysia (Miami, FL) 150–250 g (adult)
Benchtop equipment
Glass capillary puller Sutter P-97 Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment
Milli-Q water purification system Millipore Equipped with ESI source
Minicentrifuge for PCR tubes LW Scientific ZS-1
Optical Microscope Zeiss Stemi 2000C
Thermocycler Techne EW-93945-01
HPLC column and consumables
Acclaim RSLC 120 C18 column Thermo Scientific 71399
Autosampler vials Thermo Scientific C4011-13
LC and MS Instrumentation and Software
DataAnalysis 4.4 software Bruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLC Thermo Scientific
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer Bruker
RStudio RStudio
Microdissection tools
Microscissors extra fine vannas 3.5” Roboz RS-5640
Tungsten needles Roboz RS-6065
Reagents/Materials
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific H3375
Alkaline phosphatase Worthington Biochemical Corp. LS004081
Ammonium acetate Honeywell 17836
benzonase (endonuclease from S. marcescens) EMD Millipore 70746-4
bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
calcium chloride Sigma-Aldrich C4901
gentamycin sulfate Fisher Scientific G1264
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
magnesium sulfate Sigma-Aldrich 208094
nucleosides test mix Sigma-Aldrich 47310-U
penicillin G Sigma-Aldrich P7794
pentostatin Sigma-Aldrich SML0508
phosphodiesterase I Worthington Biochemical Corp. LS003926
protease type XIV from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Standard glass capillaries A-M Systems 626000 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, 195-201 (2011).
  2. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46, 303-307 (2017).
  3. Kimura, S., Waldor, M. K. The RNA degradosome promotes tRNA quality control through clearance of hypomodified tRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (4), 1394-1403 (2019).
  4. Helm, M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA. Nucleic Acids Research. 34 (2), 721-733 (2006).
  5. Rezgui, V. A. N., et al. tRNA tKUUU, tQUUG, and tEUUC wobble position modifications fine-tune protein translation by promoting ribosome A-site binding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12289-12294 (2013).
  6. Shanmugam, R., et al. Cytosine methylation of tRNA-Asp by DNMT2 has a role in translation of proteins containing poly-Asp sequences. Cell Discovery. 1 (1), 1-10 (2015).
  7. Jia, G., et al. N 6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature Chemical Biology. 7 (12), 885-887 (2011).
  8. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N 1 -methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  9. Krogh, N., et al. Profiling of 2′-O-Me in human rRNA reveals a subset of fractionally modified positions and provides evidence for ribosome heterogeneity. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7884-7895 (2016).
  10. Babaian, A., et al. Loss of m1acp3Ψ Ribosomal RNA Modification Is a Major Feature of Cancer. Cell Reports. 31 (5), 107611 (2020).
  11. Chang, M., et al. Region-specific RNA m6A methylation represents a new layer of control in the gene regulatory network in the mouse brain. Open Biology. 7 (9), 170166 (2017).
  12. Wang, C. -. X., et al. METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development. PLOS Biology. 16 (6), 2004880 (2018).
  13. Engel, M., et al. The role of m6A/m-RNA methylation in stress response regulation. Neuron. 99 (2), 389-403 (2018).
  14. Widagdo, J., et al. Experience-dependent accumulation of N6-Methyladenosine in the prefrontal cortex is associated with memory processes in mice. Journal of Neuroscience. 36 (25), 6771-6777 (2016).
  15. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  16. Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies >1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
  17. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), 20-29 (2011).
  18. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (17), 6810-6817 (2011).
  19. Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nature Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
  20. Kærn, M., Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 451-464 (2005).
  21. Chan, C. T. Y., et al. A quantitative systems approach reveals dynamic control of tRNA modifications during cellular stress. PLOS Genetics. 6 (12), 1001247 (2010).
  22. Sun, C., Jora, M., Solivio, B., Limbach, P. A., Addepalli, B. The effects of ultraviolet radiation on nucleoside modifications in RNA. ACS Chemical Biology. 13 (3), 567-572 (2018).
  23. Heiss, M., Hagelskamp, F., Marchand, V., Motorin, Y., Kellner, S. Cell culture NAIL-MS allows insight into human tRNA and rRNA modification dynamics in vivo. Nature Communications. 12 (1), 389 (2021).
  24. Clark, K. D., Lee, C., Gillette, R., Sweedler, J. V. Characterization of neuronal RNA modifications during non-associative learning in aplysia reveals key roles for tRNAs in behavioral sensitization. ACS Central Science. 7 (7), 1183-1190 (2021).
  25. Basanta-Sanchez, M., Temple, S., Ansari, S. A., D’Amico, A., Agris, P. F. Attomole quantification and global profile of RNA modifications: Epitranscriptome of human neural stem cells. Nucleic Acids Research. 44 (3), 26 (2016).
  26. Huang, W., et al. Determination of DNA and RNA methylation in circulating tumor cells by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (2), 1378-1384 (2016).
  27. Sarin, L. P., et al. Nano LC-MS using capillary columns enables accurate quantification of modified ribonucleosides at low femtomol levels. RNA. 24 (10), 1403-1417 (2018).
  28. Clark, K. D., Philip, M. C., Tan, Y., Sweedler, J. V. Biphasic liquid microjunction extraction for profiling neuronal RNA modifications by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (18), 12647-12655 (2020).
  29. Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry: Characterizing RNA modification patterns and dynamics with single-cell resolution. Analytical Chemistry. 93 (43), 14537-14544 (2021).
  30. Guise, O. L., Ahner, J. W., Jung, M. -. C., Goughnour, P. C., Yates, J. T. Reproducible electrochemical etching of tungsten probe tips. Nano Letters. 2 (3), 191-193 (2002).
  31. Peng, W., Wu, Z., Song, K., Zhang, S., Li, Y., Xu, M. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science. 369 (6508), (2020).
  32. Rayport, S. G., Ambron, R. T., Babiarz, J. Identified cholinergic neurons R2 and LPl1 control mucus release in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 49 (4), 864-876 (1983).
  33. Rosen, S. C., Weiss, K. R., Goldstein, R. S., Kupfermann, I. The role of a modulatory neuron in feeding and satiation in Aplysia: effects of lesioning of the serotonergic metacerebral cells. Journal of Neuroscience. 9 (5), 1562-1578 (1989).
  34. Lloyd, P. E., Kupfermann, I., Weiss, K. R. Central peptidergic neurons regulate gut motility in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 59 (5), 1613-1626 (1988).
  35. Crain, P. F. Preparation and enzymatic hydrolysis of DNA and RNA for mass spectrometry. Methods in Enzymology. 193, 782-790 (1990).
  36. Kadakkuzha, B. M., et al. Age-associated bidirectional modulation of gene expression in single identified R15 neuron of Aplysia. BMC Genomics. 14 (1), 880 (2013).
  37. Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51075 (2014).
  38. Tardu, M., Jones, J. D., Kennedy, R. T., Lin, Q., Koutmou, K. S. Identification and quantification of modified nucleosides in saccharomyces cerevisiae mRNAs. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1403-1409 (2019).
  39. Heiss, M., Reichle, V. F., Kellner, S. Observing the fate of tRNA and its modifications by nucleic acid isotope labeling mass spectrometry: NAIL-MS. RNA Biology. 14 (9), 1260-1268 (2017).

Tags

RNA ModificationsSingle NeuronsMass SpectrometryPost-transcriptional RegulationAplysia CalifornicaGanglia IsolationProtease TreatmentNeuron IsolationArtificial SeawaterMass Spectrometry Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63940, doi:10.3791/63940 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image