Summary

結核 菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮

Published: May 19, 2022
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Summary

このプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、培養上清から 結核菌 群細胞外小胞を富化するための容易で再現性のある技術を記載する。

Abstract

細菌感染の文脈における細胞外小胞(EV)の役割は、微生物生理学を理解するための新しい道として浮上している。具体的には、 結核菌 (Mtb)EVは、宿主と病原体の相互作用と環境ストレスに対する応答において役割を果たしている。Mtb EVも抗原性が高く、ワクチン成分としての可能性を示しています。Mtb EVを精製する最も一般的な方法は、密度勾配超遠心分離です。このプロセスには、低スループット、低収率、高価な機器への依存、技術的課題など、いくつかの制限があり、結果として得られる調製物に悪影響を及ぼす可能性があります。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、超遠心分離の限界の多くに対抗する、より穏やかな代替方法です。このプロトコルは、SECがMtb EV濃縮に効果的であり、迅速かつスケーラブルな方法で収量を増加させる高品質のMtb EV調製物を製造することを実証しています。さらに、定量および適格性認定手順による密度勾配超遠心分離との比較は、SECの利点を実証しています。EV量(ナノ粒子追跡解析)、表現型(透過型電子顕微鏡)、含有量(ウェスタンブロッティング)の評価はMtb EVに合わせて調整されていますが、提供されるワークフローは他の抗酸菌にも適用できます。

Introduction

病原体による細胞外小胞(EV)放出は、感染症を制御するための新しい技術を解き放つ鍵となる可能性がある1 結核菌(Mtb)は、世界人口の約3分の1に感染し、毎年何百万人もの人々の命を奪っている、重大な結果をもたらす病原体です2。MtbによるEV生産は、感染の文脈におけるこれらのEVの生合成および様々な役割(すなわち、免疫刺激性、免疫抑制性、鉄および栄養素の獲得)において十分に文書化されているが、とらえどころがない3,4,5Mtb EVsの組成を理解するための努力は、免疫学的に重要な脂質およびタンパク質を含む原形質膜に由来する50〜150nmの脂質膜封入スフェアを明らかにした3,6。細菌生理学におけるMtb EVの役割の調査により、生存のための環境ストレスに対する細菌EV調節の重要性が明らかになった5。宿主-病原体相互作用研究は解釈がより複雑であったが、Mtb EVが宿主の免疫応答に影響を与え、効果的なワクチン接種成分として潜在的に役立つ可能性があることを示す証拠がある3,4,7。

これまでのところ、Mtb EVのほとんどの研究では、小胞濃縮のために密度勾配超遠心分離に依存してきました8。これは小規模な研究に効果的です。ただし、この手法にはいくつかの技術的および物流上の課題があります。代替ワークフローは、全細胞と大きな破片を除去するための多段階遠心分離と、EVをペレット化する最終的な超遠心分離ステップを組み合わせます。この方法論は、効率が異なり得、そしてしばしば、可溶性非小胞関連生体分子の低収率および共精製をもたらし、小胞の完全性にも影響を及ぼす9。さらに、このプロセスは時間がかかり、手作業に時間がかかり、機器の制約によりスループットが非常に制限されています。

本プロトコルは、密度勾配超遠心分離に代わる技術であるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)について記載する。この方法は環境マイコバクテリアについて実証されており、現在の研究ではMtb10に外挿されている。市販のカラムおよび自動分画コレクターは、小胞調製における一貫性を改善し、特定の高価な装置の必要性を低減することができます。密度勾配超遠心分離と比較して数分の一の時間でこのプロトコルを完了し、スループットを増加させることもできる。この技術は技術的に難しくなく、習得が容易になり、実験室間/実験室内の再現性を高めることができます。最後に、SECは分離効率が高く、穏やかで、小胞の完全性を維持します。

Protocol

コロラド州立大学機関バイオセーフティ委員会は、本研究を承認した(19-046B)。 結核菌 の培養とEVに富む培養上清の採取は、高封じ込め研究所の訓練を受けた職員によって行われました。材料は、有効な不活性化方法が実施され、確認され、および機関のバイオセーフティポリシーによって承認された後、高封じ込め領域から移動された。プロトコルを複製している間に、検証された不…

Representative Results

結 核菌 (Mtb)由来の培養濾液タンパク質(CFP)を濃縮、定量し、次いで3mgの物質をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムにアプライした。タンパク質および粒子濃度を、それぞれBCAおよびNTAによって列挙した。タンパク質および粒子回収の期待される範囲と、これらの結果について得られた正確な値を 表1に報告する。これらの範囲よりはるかに高い値は、汚染またはカラ?…

Discussion

結核菌の細胞外小胞は抗原性の高い貯留層であり、診断ツールや将来のワクチンを開発するための魅力的な道として提示されています4,19,20歴史的に、密度勾配超遠心分離は、Mtb EVを他の可溶性、分泌物質8から分離するために使用されてきた。このプロセスは効果的ですが、時間がかかり、技術?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

獣医学部・生物医学科学部体験賞と大学研究評議会共有研究プログラムからNKGへの支援と、ATCC(賞#2016-0550-0002)によるKMDへの資金提供に感謝します。我々はまた、技術サポートについてアン・シンプソン、NIAID、NIHの以下の試薬について、以下の試薬について感謝したいと思います:モノクローナル抗結核菌LpqH(ジーンRv3763)、IT-54(インビトロで生産)、NR-13792、モノクローナル抗結核菌GroES(遺伝子Rv3418c)、クローンIT-3(SA-12)(インビトロで生産)、NR-49223、およびモノクローナル抗結核菌LAM、クローンCS-35(インビトロで生産)、NR-13811。

Materials

20x MES SDS Running Buffer ThermoFisher Scientific NP0002
96 well plate Corning 15705-066
Automatic Fraction Collector IZON Science AFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein Ladder Invitrogen 10748010
Benchtop centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R
Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff Millipore Sigma UFC710008 Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting System ThermoFisher Scientific 09-528-135
EM Grade Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids Electron Microscopy Sciences FCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL AbCam ab6790 Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron Microscope JOEL
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Microplate reader BIOTEK Epoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) BEI Resources NR-49223 Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) BEI Resources NR-13792 Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 BEI Resources NR-13811 Primary antibody
NanoClean 1070 Fischione Instruments For plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software Malvern Panalytical NS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm BioRad 1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels ThermoFisher Scientific NP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium Corning 21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050
qEV Original 35 nm 5/pk IZON Science SP5-USD SEC column
SDS sample buffer Boster AR1112 In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamber ThermoFisher Scientific EI0001
Sigmafast BCIP/NBT Millipore Sigma B5655
Silver Stain Plus Kit BioRad 1610449 In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400

References

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Cite This Article
Ryan, J. M., Dobos, K. M., Kruh-Garcia, N. A. Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography. J. Vis. Exp. (183), e63895, doi:10.3791/63895 (2022).

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