Summary

Tortricidae 해충 곤충의 대량 사육 및 분자 연구

Published: March 25, 2022
doi:

Summary

본 프로토콜은 실험실에서 tortricid 해충 곤충의 사육 방법을 설명합니다. 곤충의 성별을 구별하고 높은 처리량의 시퀀싱을 위해 핵산을 추출하는 절차는 두 개의 tortricid 해충을 사용하여 확립됩니다.

Abstract

Tortricidae (Lepidoptera)는 일반적으로 tortrix 또는 leafroller 나방으로 알려져 있으며 심각한 농업 손실을 초래하는 많은 농업 및 임업 해충으로 구성됩니다. 그러한 해충 나방의 생물학을 이해하기 위해서는 근본적인 기술이 많이 요구되어 왔습니다. 여기에서, 질량 사육, 관찰 및 분자 연구를위한 방법은 두 개의 차 tortrix, Homona magnanimaAdoxophyes honmai (Lepidoptera : Tortricidae)를 사용하여 개발됩니다. 곤충은 얇게 썬 인공 식단으로 대량 사육되었으며 생물학적 특성을 고려하여 100 세대 이상 근친 교배로 유지되었습니다. 곤충은 다양한 성 이형성을 가지고 있습니다. 따라서 후속 분석을 방해 한 개발 단계에서 성별을 구별하는 것은 어렵습니다. 본 연구는 토트리시드 유충의 성별이 여성 특이적 W 염색체를 시각화하기 위해 고환 또는 락틱 – 아세트산 오르세인 염색을 관찰함으로써 결정될 수 있음을 강조했다. 또한, 성 결정 방법을 사용하여, 본 연구는 성 결정된 배아로부터 핵산 추출을 가능하게 하고 높은 처리량 시퀀싱을 향한 응용을 가능하게 하였다. 이 팁은 다른 해충 곤충에 적용 할 수 있으며 더 많은 형태 학적 및 유전 적 연구를 촉진 할 것입니다.

Introduction

Lepidopteran 곤충은 설명 된 모든 살아있는 종 1의10 % 이상을 나타내며, 특정 택시 종은 식물에 심각한 피해와 심각한 농업 손실 2,3을 초래합니다. 누에 봄비엑스 모리4,5와 같은 모델 곤충을 사용하여 분자 및 유전 연구가 개발되었지만 해충 곤충은부분적으로 6,7을 사육하고 처리하는 데 어려움이 있기 때문에 조사되지 않은 채로 남아 있습니다. 따라서 이러한 비 모델 해충 곤충의 생물학을 이해하기 위해서는 근본적인 연구와 기술이 필요합니다.

Tortricidae (Lepidoptera)는 일반적으로 tortrix 또는 leafroller 나방으로 알려져 있으며 많은 농업 및 임업 해충을 포함합니다 8. 곤충 택시 중 동양 차 토트릭스 호모나 마그나니 마 디아코노프와 여름 과일 토르트릭 스 아독소피에스 혼마이 야스다(Adoxophyes honmai Yasuda)는 동아시아7의 티 트리를 손상시키는 것으로 알려진 심각한 다식성 해충이다. 두 종은 모성 분비물로 덮인 얇고 부드럽고 깨지기 쉬운 알로 구성된 평평하고 타원형의 비늘과 같은 달걀 클러스터 (또는 달걀 덩어리)를 낳습니다. 배아 발생 단계는 곤충 발달과 성 결정9에 중요하지만, 난자의 구조는 추가 분석이 곤충의 생물학을 이해하는 것을 방해합니다. 이러한 복잡한 난자 덩어리를 산란시키는 해충에 대한 추가 연구를위한 어려움을 극복하는 것이 중요합니다.

여기에서, tortricids의 생물학을 이해하기 위해, 대량 양육, 관찰 및 분자 연구를위한 방법이 A. honmaiH. magnanima를 사용하여 개발되었습니다. 첫째, 대량 사육 방법은 교배에 의해 100 세대 이상 두 토트리시드를 유지합니다. 연접 스케일 유사 난자 질량으로부터 난자를 분리하는 것은 파리10에서 사용 된 기술로부터 이전에 개발 된 알칼리성 및 유기 용매를 사용하여 토트리시드의 배아 발생 관찰을 촉진시켰다. 또한, 본 연구는 락틱-아세트산 오르세인11을 이용한 레피도프테란 암컷의 성염색물의 염색법을 개발함으로써 작은 배아의 성차별을 확립하였다. 이러한 방법들을 조합함으로써, 높은 품질과 양의 핵산이 결정성 배아로부터 추출되었고, 이는 그렇지 않으면 확립하기 어려웠던6. 추출된 RNA는 차세대 시퀀싱에 활용되었다. 총체적으로, 여기에 제시된 방법은 다른 lepidopteran 곤충 및 다른 곤충 택시에 적용됩니다.

Protocol

1. 곤충 수집 및 대량 사육 이전에 출판 된 참고 문헌 8,12에 따라 들판에서 tortricid 곤충을 수집하십시오.참고 : H. magnanima 및 A. honmai 유충은 손상된 찻잎에서 수집됩니다 (그림 1A); 성인은 4W 휴대용 UV 광 (365nm 파장, 재료 표, 그림 1B 참조)을 사용하여 끌립니다.</…

Representative Results

호스트 라인의 설립 및 유지 보수현장에서 수집 된 유충의 생존 가능성은 현장 위치, 계절 및 양육 조건 (예 : Arai et al.12에 표시된 바와 같이 대만, 타오 위안에서의 생존 가능성의 90 %)에 따라 다르게 기인합니다. 약 30 % -50 %의 쌍이 평소와 같이 다음 세대를 생성합니다. H. magnanima 와 A. honmai의 경우, 모계는 100 세대 이상 근친 교배에 의해 유지되었습?…

Discussion

Tortricid는 여러 농업 및 임업 해충을 포함합니다. 본 연구는 세대에 걸쳐 토트릭스를 후방하고, 곤충의 배아 발생과 성별을 관찰하고, 성숙한 배아를 사용하여 분자 분석을 수행하는 방법을 제시했습니다.

해충 곤충 연구의 장애물 중 하나는 사육 방법을 수립하는 것입니다. 특히, 근친 교배는 때때로 종의 적합성에 부정적인 영향을 미칩니다. 근친 교배 우울증이라고 불리는 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 젊은 과학자를위한 일본 과학 진흥 학회 (JSPS) 연구 펠로우십 [보조금 번호 19J13123 및 21J00895]의 지원을 인정하고자합니다.

Materials

1/2 ounce cup FP CHUPA CP070009 insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid FP CHUPA CP070011 insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 36289 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies not shown Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit Agilent Technologies 5067-1511 Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG
.pdf
benzalkonium chloride solution Nihon Pharmaceutical Co., Ltd No.4987123116046 Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton AOUME 8-1611-02 insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution Dojindo, Tokyo, Japan 340-07971 stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit Invitrogen Q33231 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column Epoch Life Science Inc. EP-11201 RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper HEIKO 2100010 insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&
utm_medium=cpc&utm_source=
Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK ATTO, Tokyo, Japan 4002620 incubation; https://www.attoeng.site/
heptane FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF Nosan Co., Ltd not shown Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII Nippon Gene 311-07361 RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex Biosan BS-010210-TAK Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80 Implen not shown Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide Inomata chemical 1859 insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3%
83%A9%E3%83%AB%E3%83%91%
E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%
AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7770S Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde FUJIFILM Wako Chemicals Co. 160-16061 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan not shown Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen, MA, USA P36965 antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution Merck 71049-4CN DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution Qiagen 158912 DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_
BIOCOMPARE_ProductListing_
0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4 Invitrogen Q33238 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit Invitrogen Q32855 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution Nippon Gene 313-01461 RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S Nosan Co., Ltd not shown Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water Invitrogen 10977023 RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015

References

  1. Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
  2. Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
  3. Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
  4. Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
  6. Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
  7. Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
  8. vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. . Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , (1991).
  9. Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
  10. Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
  11. Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
  12. Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
  13. Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
  14. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
  15. Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
  16. Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
  17. Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
  18. Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
  19. Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
  20. Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
check_url/63737?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects. J. Vis. Exp. (181), e63737, doi:10.3791/63737 (2022).

View Video