Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae
Summary
El presente protocolo describe el método de cría de insectos plaga tortricidas en los laboratorios. Los procedimientos para distinguir el sexo de los insectos y extraer ácidos nucleicos para la secuenciación de alto rendimiento se establecen utilizando dos plagas tortricidas.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como polillas tortrix o leafroller, comprende muchas plagas agrícolas y forestales, que causan graves pérdidas agrícolas. Para comprender la biología de tales polillas plaga, las técnicas fundamentales han tenido una gran demanda. Aquí, los métodos para la cría en masa, las observaciones y los estudios moleculares se desarrollan utilizando dos tortrix de té, Homona magnanima y Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Los insectos fueron criados en masa con una dieta artificial en rodajas y mantenidos por endogamia durante más de 100 generaciones teniendo en cuenta sus características biológicas. Los insectos tienen varios dimorfismos sexuales; por lo tanto, es difícil distinguir el sexo durante las etapas de desarrollo, que han impedido los ensayos posteriores. El presente trabajo destacó que el sexo de las larvas de tortricidas podría determinarse mediante la observación de testículos o tinción de orceína láctico-acética para visualizar el cromosoma W específico de la hembra. Además, utilizando los métodos de determinación del sexo, el presente estudio permitió la extracción de ácido nucleico de embriones determinados por sexo y la aplicación hacia la secuenciación de alto rendimiento. Estos consejos son aplicables para otros insectos plaga y facilitarán más estudios morfológicos y genéticos.
Introduction
Los insectos lepidópteros representan más del 10% de todas las especies vivas descritas1, y ciertas especies de taxones causan graves daños a las plantas y graves pérdidas agrícolas 2,3. Aunque se han desarrollado estudios moleculares y genéticos utilizando modelos de insectos como el gusano de seda Bombyx mori 4,5, los insectos plaga siguen sin ser investigados, en parte debido a las dificultades para la cría y manipulación 6,7. Por lo tanto, los estudios y técnicas fundamentales son necesarios para comprender la biología de tales insectos plaga no modelo.
Los Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como tortrix o polillas de las hojas, comprenden muchas plagas agrícolas y forestales8. De los taxones de insectos, la tortrix oriental del té Homona magnanima Diakonoff y la tortrix de frutas de verano Adoxophyes honmai Yasuda son plagas polífagas graves que se sabe que dañan los árboles de té en el este de Asia7. Las dos especies ponen racimos de huevos planos y ovalados (o masas de huevos) que consisten en huevos delgados, blandos y frágiles cubiertos por secreciones maternas. Aunque las etapas de embriogénesis son cruciales para el desarrollo de insectos y las determinaciones del sexo9, las estructuras de los huevos impiden que un análisis más detallado comprenda la biología de los insectos. Es importante superar las dificultades para un mayor estudio de las plagas que oviponen una masa de huevos tan compleja.
Aquí, para comprender la biología de los tortricidos, se han desarrollado métodos para la cría en masa, observaciones y estudios moleculares utilizando A. honmai y H. magnanima. En primer lugar, los métodos de cría en masa mantienen a ambos tortricidos más de 100 generaciones por endogámicos. La separación de los huevos de la masa de huevo concatenada similar a una escama facilitó la observación de la embriogénesis de los tortricidos utilizando disolventes alcalinos y orgánicos previamente desarrollados a partir de técnicas utilizadas en moscas10. Además, el presente estudio estableció la discriminación sexual de embriones pequeños mediante el desarrollo de métodos de tinción de la cromatina sexual de hembras lepidópteras utilizando orceína láctico-acética11. Mediante la combinación de estos métodos, se extrajeron ácidos nucleicos de alta calidad y cantidad de embriones determinados por sexo, lo que de otro modo sería difícil de establecer6. El ARN extraído se utilizó para la secuenciación de próxima generación. Colectivamente, los métodos presentados aquí se aplican a otros insectos lepidópteros y otros taxones de insectos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tortricid comprende varias plagas agrícolas y forestales; el presente estudio presentó métodos para criar tortrix a lo largo de generaciones, observar la embriogénesis y el sexo de los insectos, y realizar análisis moleculares utilizando embriones maduros.
Uno de los obstáculos para el estudio de insectos plaga es establecer métodos de cría. Especialmente, la endogamia a veces afecta negativamente la aptitud de la especie. La reducción de la aptitud física por la consanguínea, llama…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el apoyo de las Becas de Investigación para Jóvenes Científicos de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) [Número de subvención 19J13123 y 21J00895].
Materials
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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