Липидомика тканей грызунов

Несмотря на то, что достижения в области рассеянного склероза привели к появлению различных методов точного мониторинга многих видов липидов, предыдущее липидное профилирование различных тканей млекопитающих не показало последовательных результатов, и, следовательно, конкретные тканеспецифические функции липидов остаются неясными. По сравнению с функциональным анализом белков, для которого доступны более надежные подходы к нокаутированию экспрессии конкретных соединений, большинство липидов не могут быть селективно отключены или сверхэкспрессированы в тканях, что затрудняет функциональную оценку липидов. Расширенное профилирование концентраций липидомов в тканях может обеспечить альтернативный подход к выявлению связей между циркулирующими липидами и заболеваниями человека.

При оценке комплексных методов липидомики, способных качественно и количественно охватить эндогенный липидный профиль любой ткани мыши, мы отдали предпочтение методу дробовиковой липидомики. В целом, возможны два противоположных типа анализа образцов: либо полностью нецелевой скрининг липидов с использованием разделения на основе жидкостной хроматографии (ЛХ) с дальнейшим масс-спектрометрическим обнаружением для выявления общей липидной сложности образца, либо целевые подходы, которые в основном позволяют очень точно определить конкретные липиды, представляющие интерес. В отличие от этого, сильной стороной представленного рабочего процесса липидомики является быстрый всесторонний охват сотен эндогенных липидов из заранее определенных классов липидов, который все еще может быть выполнен надежным полуколичественным образом.

Эффективность ионизации различных классов липидов зависит от структуры и может сильно варьироваться в зависимости от различных условий экспериментальной ионизации. В отличие от методов разделения на основе LC, анализ дробовика сводит к минимуму эти различия за счет прямой одновременной инфузии всего липидного экстракта в тех же условиях ионизации в прибор MS. Использование изотопно меченных аналогов липидов или структурно сходных неэндогенных стандартов позволяет проводить полуколичественную оценку всех классов липидов. Дробовиковая липидомика обеспечивает низкую меж- и внутрипрогонную вариабельность при анализе МС; В результате этот метод дает более низкие коэффициенты вариации²¹ , чем методы, основанные на нецелевой жидкостной хроматографии, которые требуют нескольких стандартов для адекватного количественного определения. Важно отметить, что, хотя в текущем методе не используется внешняя калибровочная кривая, метод по-прежнему считается полностью количественным³².

Один уровень меченого внутреннего стандарта (или немеченого стандарта, который не экспрессируется эндогенно) для каждого класса липидов достаточен для количественной оценки большинства липидов. Лишь в нескольких публикациях сообщалось о частичной валидации метода липидомики дробовика. Например, в работах Gryzbek et ^al.17 и Surma et ^al.21 были подготовлены обратные калибровочные кривые с использованием внутренних стандартов и матрицы с фиксированным количеством образцов. Линейность оценивали с помощью линейной регрессии логарифмически преобразованных количеств липидов и их интенсивности и сообщали как R² и наклон соответственно. Предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ) были определены с помощью взвешенной линейной регрессии, основанной на отношении сигнал/шум 3 для LOD и 10 для LOQ. Для большинства классов липидов LOQ определялся между 2-9,8 пмоль для жировой ткани и 0,05-5 мкМ в плазме. В обоих случаях для получения оценок для всех липидов в классе использовались неэндогенные единичные внутренние стандарты для каждого класса. Однако в этой работе мы не предоставляем LOD/LOQ из-за нескольких проблем: эндогенная матрица не свободна от соединений, а суррогатная матрица для тканей недоступна – при этом всплеск небольших известных количеств стандартов невозможен. Мы не применяем классический подход к таргетной количественной оценке с использованием ряда калибровочных кривых конкретного соединения, нормализованного его идентичным изотопно меченным стандартом, из-за отсутствия чистых эталонов и очень ограниченной доступности изотопно меченных липидов. Орбитальные детекторы автоматически выполняют преобразование переходного сигнала, применяя преобразование Фурье, и некоторый сигнал уже подставляется – в результате нижний диапазон концентраций будет линейным только до некоторого минимального сигнала, ниже которого молекула больше не будет обнаруживаться. Значения сигнал/шум программного обеспечения Xcalibur зависят от отношения m/z молекулы; В результате соединения каждого класса липидов, содержащие различные комбинации жирных кислот, будут иметь разные значения шума. Кроме того, значения LOQ/LOQ строго связаны с типом матрицы, и когда количественная оценка липидома проводится в различных тканях грызунов, это должно быть отражено оценкой LOQ для каждого типа ткани в отдельности.

Фактически, метод предлагает высокий диапазон линейной динамической количественной оценки до четырех порядков^{величины 33} и очень хорошую чувствительность для охвата наиболее важных эндогенных структурных липидов, которая может быть дополнительно увеличена за счет технических усовершенствований в получении МС³². Коэффициенты вариации средних концентраций липидов были в основном ниже 15%, что означает, что липидомика дробовика соответствует требованиям Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в качестве метода, который следует рассматривать для исследований надлежащей лабораторной практики (GLP) и надлежащей клинической практики (GCLP)³⁴.

Однако следует отметить, что из-за их разной полярности на некоторые классы липидов гораздо больше влияет вклад специфических конъюгированных ЖК. Это приводит к искажению интенсивности реакции в эквимолярных смесях, содержащих широкий спектр сопряженных ЖК, что приводит к смещению количественного определения, как подчеркивается Koivusalo et ^al.35 для классов фосфолипидов. Следует отметить, что эти авторы представили данные для широкого диапазона ЖК длиной цепи от 24 до 48, что, вероятно, не отражает ситуацию в реальном биологическом образце. Реакция для полиненасыщенных видов была на 40% выше, чем для полностью насыщенных видов, но этот эффект наблюдался только для более высоких концентраций. Когда смесь постепенно разбавляли, эффект ненасыщенности постепенно уменьшался и практически исчезал при 0,1 пмоль/мкл на вид. Кроме того, все измерения проводились на приборах с ионными ловушками и тройными квадруполями, а не на оборудовании Q-Exactive.

Еще одним преимуществом представленного рабочего процесса является его техническая гибкость, которая позволяет адаптироваться к конкретным требованиям проекта. Например, любой протокол экстракции липидов, такой как модифицированные методы Блая и Дайера³⁶, метил-трет-бутилового эфира 37 или бутанол-метанола³⁸, может быть использован для получения общего липидного экстракта перед анализом МС. Основным ограничением хлороформ-метанольной экстракции является то, что нижняя фаза содержит липидную фракцию, что усложняет рутинную работу и особенно автоматизацию; Кроме того, необходимо учитывать токсичность хлороформа. Экстракция трет-бутилового эфира широко используется для липидного анализа образцов^{плазмы 37}, и был предложен автоматизированный вариант²¹. В данном случае мы выбрали метод BUME, поскольку он обеспечивает еще лучшее восстановление для шипованных липидов классов³⁸ PG, PI, PA и PS, более низкий расход растворителя и возможность автоматизации³⁹, в то время как общие концентрации, количественно определенные для образцов тканей, извлеченных всеми тремя методами, были сопоставимы. Кроме того, несмотря на то, что в текущей работе отбор проб выполнялся вручную, также можно получить воспроизводимые и точные результаты из больших наборов проб путем автоматизированной пробоподготовки и экстракции липидов в 96-луночном формате^40,41. Это позволяет внедрять липидомный анализ в масштабные клинико-токсикологические исследования.

В текущей работе мы выполнили получение МС положительных и отрицательных мод отдельно без переключения полярности, как описано Schuhmann et ^al.42. Стабильность сигнала наномата лучше в отрицательном режиме для чуть менее концентрированного раствора, чем в положительном режиме. Кроме того, мы разработали полностью прослеживаемую процедуру с помощью программного преобразователя файлов .raw в mzML, которая предоставляет значения, указываемые в программном обеспечении LipidXplorer – при этом не требуются ручные расчеты наклона разрешения. Мы также применили различные подстановки настроек шума, потому что в положительном режиме уровни шума спектров выше, чем в отрицательном режиме. Все этапы были оптимизированы для прослеживаемого и высокопроизводительного рутинного анализа.

Для идентификации анализ липидомики дробовика может использовать уникальное поведение различных классов липидов, которые образуют уникальные аддукты в разных режимах полярности. В этом методе частицы ПК и ПЭ с одинаковой молекулярной массой, которые перекрываются в режиме положительной ионизации, могут быть полностью разделены в режиме отрицательной ионизации, поскольку ПК образует аддукты ацетата или формиата, а ПЭ ионизируется в депротонированной форме. Кроме того, возможна (частичная) структурная деконволюция для метода, использующего не только молекулярную формулу, но и объемную структуру жирных кислот. Например, идентификация FA по уровню общего углерода и общему количеству ненасыщенных работает для всех фосфолипидов, DAG, TAG и лизофосфолипидов. Количественное определение каждой изомерной формы снизу вверх может быть частично выполнено для некоторых классов^{фосфолипидов 43} , но является гораздо более сложным для DAG и TAG из-за неодинакового сигнального отклика различных FA в спектрах MS2.

Важно также подчеркнуть необходимость внедрения соответствующих процедур контроля качества, полностью согласующихся с недавними инициативами в этой области⁴⁴. Поскольку мы хотим обеспечить надлежащую прослеживаемость и воспроизводимость данных между лабораторией и внутри нее, был предпринят ряд шагов, таких как надлежащая рандомизация образцов для всех этапов анализа, работа со стандартными смесями, сертифицированными поставщиками, включение образцов контроля качества, процедуры проверки приемки или отбраковки партии, а также создание внутренней базы данных для отслеживания эффективности контроля качества в долгосрочной перспективе. Кроме того, этим инициативам соответствует потребность в стандартизированном методе решения проблемы стабильности образца. В целом, большинство структурных липидов не подвержены окислению липидов, что более актуально для оксилипинов, окисленных липидов и полиненасыщенных жирных кислот, которые, следовательно, гораздо более чувствительны к условиям хранения и обработки. Однако правильная оценка стабильности образца по-прежнему является технически сложной задачей.

Однако этот протокол имеет ограничение, когда речь идет об определении субмолекулярных уровней соединений. Учитывая, что нет разделения общего экстракта, все изоформы липидов с одинаковой молекулярной массой, но разным составом жирных кислот объединяются в анализе MS. Для большинства классов можно добиться частичной деконволюции структуры с помощью коэффициентов фрагментации остаточных фрагментов жирных кислот в MS2. Однако независимая количественная оценка каждой изоформы остается особенно сложной задачей из-за больших различий в фрагментационном поведении различных изоформ и того факта, что чистые химические стандарты не доступны в достаточно большом разнообразии для определения значений компенсации. Другим ограничением является то, что процесс ESI неизбежно генерирует артефакты, что приводит к искусственной генерации пиков для некоторых липидов, таких как DAG, Pas и FA, что может привести к ошибочной количественной оценке.

Далее мы суммируем наиболее важные части протокола, основанные на нашем опыте. Первый связан с тем, что каждый тип ткани мыши имеет уникальный липидный профиль как с точки зрения количества липидов, так и с точки зрения соотношения классов. При этом исходные количества ткани на основе общего содержания белка перед экстракцией должны быть тщательно определены, чтобы не насыщать сигнал МС и не выходить из динамического диапазона количественного определения из-за агрегации липидов при высоких концентрациях³³ или – в противоположном полюсе – обеспечить достаточный сигнал МС для охвата основных липидных соединений для каждого класса липидов.

Вторым важным аспектом является обеспечение правильного совмещения положения выходного отверстия чипа наноисточника прямой инфузии с трансферным капилляром масс-спектрометра. Учитывая, что полная калибровка масс-спектрометра в обоих режимах выполняется еженедельно, переключение между калибровочным источником и настройкой чипа наноисточника может быть причиной резкой изменчивости интенсивности сигнала из-за смещения во время установки.

Еще одной важной частью протокола является тщательное обращение с внутренним набором стандартов. Поскольку эта смесь содержит значительное количество дихлорметана, после вскрытия ее следует быстро употребить, чтобы избежать длительного хранения и многократного использования, приводящего к испарению и искусственному изменению концентрации. Кроме того, важно последовательное обращение со стандартной смесью после извлечения из хранилища при температуре −20 °C, поскольку перепады температур могут привести к несоответствиям объема во время пипетирования пипетками на воздушной подушке. Один из вариантов может заключаться в замене дихлорметана в стандартном буфере ресуспендирования чистым метанолом, что могло бы повысить удобство обработки, но могло бы отрицательно сказаться на растворимости некоторых классов липидов и, таким образом, снизить точность количественной оценки этих классов липидов.

Последней важной частью является обработка данных. Рабочий процесс обработки данных сочетает в себе программное преобразование Peak by Peak из формата .raw в формат .mzML, применение усреднения сканирования MS2 и фильтрации шума MS1 и MS2, а также пикового выбора и сжатия данных. В качестве альтернативы программное обеспечение Proteowizard также можно использовать для преобразования данных, но в этом случае несколько настроек в LipidXplorer должны быть определены вручную. Вся сложность липидомики дробовика особенно сконцентрирована на этапе деконволюции спектров прямого впрыска MS1 и MS2. Программное обеспечение LipidXplorer с открытым исходным кодом импортирует преобразованные спектры из формата файла mzML на основе точности массы, массового разрешения и наклона его изменения с увеличением m/z. Программное обеспечение объединяет несколько отдельных спектров МС и МС / МС, полученных в ходе анализа. После этого он выравнивает отдельные пики в разных прогонах выборки, и в каждом кластере выровненных пиков он заменяет их массы их единой взвешенной по интенсивности средней массой, в то время как их содержание в каждом файле данных остается нетронутым. Репрезентативные массы выровненных кластеров пиков и отдельные пиковые интенсивности хранятся в базе данных главного сканирования. База данных главного сканирования содержит все спектры MS1 и MS2, сгенерированные для всех образцов в партии, и может быть деконволютирована для идентификации липидов с помощью запросов, написанных на языке запросов молекулярной фрагментации (MFQL).

В целом, метод охватывает идентификацию липидов DAG, TAG и SE на основе положительной моды и липидов PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC и LPE на основе получения отрицательной моды. Во время идентификации липидов проводится изотопная коррекция для MS1 и MS2, а скорректированные интенсивности сообщаются в выходном файле .xlsx. В качестве альтернативы доступно несколько других программ для обработки данных дробовика, таких как ALEX⁴⁵ и LipidHunter⁴⁶.

Жирные кислоты – основные ядерные и клеточные мембранные компоненты – хранятся в виде фосфолипидов для дальнейшего превращения в биологически активные молекулы. Они могут быть преобразованы ферментами лизофосфолипидацилтрансферазы в лизофосфолипиды через путь⁴⁷ Лендса. Например, известно, что фермент LPCAT3 демонстрирует высокую специфичность для включения АА в промежуточные продукты лизофосфатидилхолина и лизофосфатидилсерина. Относительно высокая экспрессия этих ферментов была зарегистрирована в воспалительных клетках, таких как альвеолярные макрофаги и эпителиальные клетки^{бронхов 47}, что приводило к высвобождению больших относительных пропорций АА-содержащих фосфолипидов в этих клетках. Однако после их высвобождения из мембранных фосфолипидов фосфолипазой А2 превращение ПНЖК в различные типы липидных медиаторов катализируется многими ферментами⁴⁸. Кроме того, эти ПНЖК могут стать субстратом для производства провоспалительных и противовоспалительных простагландинов посредством действия ферментов циклооксигеназы (ЦОГ)-1 и ЦОГ-2⁴⁷. Фосфолипиды являются одним из источников липидных медиаторов, высвобождаемых в определенных местах, где эти медиаторы должны демонстрировать свои биологические эффекты.

Легкое представляет собой сложный орган, состоящий из нескольких типов клеток, каждый из которых играет перекрывающуюся и нишевую роль в содействии нормальному развитию и функционированию легких. Было проведено всего несколько исследований для выделения и профилирования различных типов клеток в легких мыши или человека (например, альвеолярных клеток 2-го типа)^49,50; Другие основные типы клеток легких не были охарактеризованы. Еще одно интересное исследование⁵¹ было проведено для выделения и проведения липидного анализа эндотелиальных, эпителиальных, мезенхимальных и смешанных иммунных клеток в легких мыши. Было замечено, что концентрация ПНЖК, включенных в PCO и PG, была обогащена в иммунных клетках. Учитывая тот факт, что CS индуцирует увеличение иммунных клеток в легких (в 4-5 раз), что оценивается с помощью бронхоальвеолярного лаважа (BAL)⁵², общие изменения липидов, наблюдаемые в этом исследовании, могут быть объяснены кумулятивным увеличением рекрутирования иммунных клеток в легких мыши.

В заключение, наблюдаемое искажение мононенасыщенных жирных кислот и ПНЖК, включенных в фосфолипиды, может отражать избыток определенных ЖК в клетке и/или представлять собой внутриклеточный ресурс предшественников оксилипина, которые перепродуцируются при окислительном стрессе и воспалительных состояниях. Тем не менее, дополнительные данные о свободных ЭПК, ДГК и других оксилипинах необходимы для прояснения этого момента и выходят за рамки применения текущего метода.