Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Aunque los avances en la EM han producido una variedad de métodos para monitorear con precisión muchas especies de lípidos, el perfil lipídico anterior de varios tejidos de mamíferos no mostró resultados consistentes y, en consecuencia, las funciones específicas de los lípidos en los tejidos siguen sin estar claras. En comparación con el análisis funcional de proteínas, para el cual se dispone de enfoques más robustos para eliminar la expresión de compuestos particulares, la mayoría de los lípidos no pueden apagarse selectivamente o sobreexpresarse en los tejidos, lo que dificulta la evaluación funcional de los lípidos. El perfil avanzado de las concentraciones tisulares de lipidomas puede proporcionar un enfoque alternativo para identificar asociaciones entre los lípidos circulantes y las enfermedades humanas.

Al evaluar métodos lipidómicos integrales capaces de cubrir cualitativa y cuantitativamente el perfil lipídico endógeno de cualquier tejido de ratón, dimos preferencia al método lipidómico de escopeta. En general, son posibles dos tipos opuestos de análisis de muestras: un cribado completamente no dirigido de lípidos utilizando la separación basada en cromatografía líquida (LC) con detección espectrométrica de masas adicional para revelar la complejidad lipídica total de la muestra, o enfoques específicos, que en su mayoría permiten una cuantificación muy precisa de lípidos específicos de interés. En contraste, la característica fuerte del flujo de trabajo lipidómico de escopeta presentado es la rápida cobertura integral de cientos de lípidos endógenos de clases de lípidos predefinidas, que aún se pueden realizar de manera semicuantitativa robusta.

Las eficiencias de ionización de las diferentes clases de lípidos dependen de la estructura y pueden variar drásticamente dependiendo de las diferentes condiciones experimentales de ionización. A diferencia de los métodos de separación basados en LC, el análisis de escopeta minimiza estas diferencias debido a la infusión simultánea directa de todo el extracto lipídico bajo las mismas condiciones de ionización en el instrumento MS. El uso de análogos lipídicos marcados isotópicamente o patrones no endógenos estructuralmente similares permite la semicuantificación de todas las clases de lípidos. La lipidómica de escopeta proporciona una baja variabilidad entre y dentro de la ejecución durante el análisis de EM; Como resultado, este método produce coeficientes de variación²¹ más bajos que los métodos basados en cromatografía líquida no dirigida, que requieren múltiples estándares para una cuantificación adecuada. Es importante destacar que, si bien no se utiliza ninguna curva de calibración externa en el método actual, el método todavía se considera completamente cuantitativo³².

Un nivel de estándar interno marcado (o estándar no marcado que no se expresa endógenamente) por clase de lípidos es suficiente para la cuantificación de la mayoría de los lípidos. Solo unas pocas publicaciones han reportado una validación parcial del método para un método lipidómico de escopeta. Por ejemplo, en Gryzbek et ^al.17 y Surma et ^al.21, las curvas de calibración invertidas se prepararon utilizando patrones internos y una cantidad fija de matriz de muestra. La linealidad se evaluó mediante la regresión lineal de las cantidades de lípidos transformados logarítmicamente y sus intensidades y se informó como R² y pendiente, respectivamente. El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) se determinaron mediante regresión lineal ponderada basada en una relación señal-ruido de 3 para LOD y 10 para LOQ. Para la mayoría de las clases de lípidos, LOQ se definió entre 2-9.8 pmol para tejido adiposo y 0.05-5μM en plasma. En ambos casos, se utilizaron patrones internos únicos no endógenos por clase para derivar estimaciones de todos los lípidos de la clase. Sin embargo, en este trabajo, no proporcionamos LOD/LOQ debido a varias preocupaciones: la matriz endógena no está libre de compuestos, y la matriz sustituta para los tejidos no está disponible, con esto, el pico de pequeñas cantidades conocidas de estándares no es posible. No realizamos un enfoque clásico de cuantificación dirigida con el uso de una serie de curvas de calibración de un compuesto particular normalizado por su patrón idéntico marcado isotópicamente debido a la inexistencia de estándares puros y la disponibilidad muy limitada de lípidos marcados isotópicamente. Los detectores Orbitrap realizan automáticamente la conversión de la señal transitoria aplicando una transformación de Fourier, y alguna señal ya está sustituida; como resultado, el rango de concentración más bajo será solo lineal hasta una señal mínima, por debajo de la cual la molécula ya no será detectable. Los valores de señal-ruido del software Xcalibur dependen de la relación m/z de la molécula; Como resultado, los compuestos de cada clase de lípidos, que contienen diferentes combinaciones de ácidos grasos, tendrán diferentes valores de ruido. Además, los valores de LOQ / LOQ están estrictamente vinculados al tipo de matriz, y cuando la cuantificación del lipidoma se realiza en diferentes tejidos de roedores, debe reflejarse mediante la evaluación de LOQ para cada tipo de tejido individualmente.

De hecho, el método ofrece un alto rango de cuantificación dinámica lineal de hasta cuatro órdenes de magnitud³³ y muy buena sensibilidad para cubrir los lípidos estructurales endógenos más importantes, que pueden incrementarse aún más mediante mejoras técnicas en la adquisición de MS³². Los coeficientes de variación de las concentraciones medias de lípidos fueron en su mayoría inferiores al 15%, lo que significa que la lipidómica de escopeta cumple con los requisitos de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) como método a considerar para estudios de buenas prácticas de laboratorio (BPL) y buenas prácticas clínicas (GCLP)³⁴.

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, debido a su diferente polaridad, algunas clases de lípidos se ven mucho más afectadas por la contribución de AF conjugados específicos. Esto conduce a la distorsión en la respuesta de intensidad en mezclas equimolares que contienen una amplia gama de AF conjugadas, lo que resulta en un sesgo de cuantificación, como lo destacan Koivusalo et ^al.35 para las clases de fosfolípidos. Cabe destacar que estos autores presentaron datos para una amplia gama de AF, de 24 a 48 de longitud de cadena, lo que probablemente no refleja la situación en una muestra biológica real. La respuesta para las especies poliinsaturadas fue un 40% mayor que para las especies totalmente saturadas, pero este efecto solo se observó para concentraciones más altas. Cuando la mezcla se diluyó progresivamente, el efecto de la insaturación disminuyó gradualmente y prácticamente desapareció a 0,1 pmol/μL por especie. Además, todas las mediciones se realizaron en instrumentos de trampa de iones y cuadrupolos triples y no en equipos Q-Exactive.

Otra ventaja del flujo de trabajo presentado es su flexibilidad técnica, que permite la adaptación a los requisitos específicos del proyecto. Por ejemplo, cualquier protocolo de extracción de lípidos, como los métodos modificados de Bligh y Dyer³⁶, metil terc-butil éter 37 o butanol-metanol³⁸, se puede utilizar para preparar un extracto lipídico total antes del análisis de EM. La principal limitación de la extracción de cloroformo-metanol es que la fase inferior contiene la fracción lipídica, lo que complica el trabajo rutinario y especialmente la automatización; Además, se debe considerar la toxicidad del cloroformo. La extracción de éter terc-butílico es ampliamente utilizada para el análisis lipídico de muestras de plasma³⁷, y se ha propuesto una versión automatizada²¹. En este caso, elegimos el método BUME porque proporciona recuperaciones aún mejores para las clases de lípidos PG, PI, PA y PS³⁸, menor consumo de disolventes y la posibilidad de automatización³⁹, mientras que las concentraciones generales cuantificadas para muestras de tejido extraídas por los tres métodos fueron comparables. Además, mientras que la extracción de la muestra se realizó manualmente en el trabajo actual, también es posible obtener resultados reproducibles y precisos de grandes conjuntos de muestras mediante la preparación automatizada de muestras y la extracción de lípidos en un formato de 96 pocillos^40,41. Esto permite implementar el análisis lipidómico en estudios clínicos y toxicológicos a gran escala.

En el trabajo actual, realizamos la adquisición MS de modos positivos y negativos por separado sin cambio de polaridad como lo describen Schuhmann et ^al.42. La estabilidad de la señal del nanomate es mejor en modo negativo para una solución ligeramente menos concentrada que en modo positivo. Además, desarrollamos un procedimiento totalmente trazable con un software convertidor de archivos .raw a mzML, que proporciona los valores que se especificarán en el software LipidXplorer – con esto, no se requieren cálculos manuales de pendiente de resolución. También aplicamos diferentes sustituciones de ajuste de ruido porque, en modo positivo, los niveles de ruido de los espectros son más altos que en modo negativo. Todos los pasos se optimizaron para análisis rutinarios trazables y de alto rendimiento.

Para la identificación, el análisis lipidómico de escopeta puede explotar el comportamiento único de diferentes clases de lípidos, que forman aductos únicos en diferentes modos de polaridad. En este método, las especies de PC y PE con la misma masa molecular que se superponen en el modo de ionización positiva pueden separarse completamente en el modo de ionización negativa, ya que PC forma aductos de acetato o formiato, y PE se ioniza en forma desprotonada. Además, la deconvolución estructural (parcial) es posible para el método utilizando no solo la fórmula molecular sino también la estructura de ácidos grasos a granel. Por ejemplo, la identificación de AF en el nivel de carbono total y el recuento total de insaturación funciona para todos los fosfolípidos, DAG, TAG y lisofosfolípidos. La cuantificación ascendente de cada forma isomérica se puede realizar parcialmente para algunas de las clases de fosfolípidos⁴³ , pero es mucho más compleja para DAG y TAG debido a la respuesta de señal desigual de diferentes FA en los espectros MS2.

También es importante destacar la necesidad de aplicar procedimientos adecuados de control de calidad, plenamente alineados con las iniciativas recientes en este campo⁴⁴. Como deseamos garantizar la trazabilidad adecuada de los datos y la reproducibilidad entre y dentro del laboratorio, se han tomado una serie de medidas, como la aleatorización adecuada de las muestras para todos los pasos del análisis, el trabajo con mezclas estándar certificadas por el proveedor, la inclusión de muestras de control de calidad, procedimientos para verificar la aceptación o el rechazo del lote y la creación de una base de datos interna para rastrear el rendimiento del control de calidad a largo plazo. También es consistente con estas iniciativas la necesidad de un método estandarizado para abordar la estabilidad de la muestra. En general, la mayoría de los lípidos estructurales no se ven afectados por la oxidación de lípidos, que es más relevante para las oxilipinas, los lípidos oxidados y los ácidos grasos poliinsaturados que, por lo tanto, son mucho más sensibles a las condiciones de almacenamiento y manipulación. Sin embargo, la evaluación correcta de la estabilidad de la muestra sigue siendo una tarea técnicamente difícil.

Sin embargo, este protocolo tiene una limitación cuando se trata de determinar los niveles submoleculares de los compuestos. Teniendo en cuenta que no hay separación del extracto total, todas las isoformas de lípidos con la misma masa molecular pero diferentes composiciones de ácidos grasos se fusionan en el análisis de MS. Para la mayoría de las clases, es posible lograr la deconvolución parcial de la estructura utilizando las proporciones de fragmentación de fragmentos de ácidos grasos residuales en MS2. Sin embargo, la cuantificación independiente de cada isoforma sigue siendo una tarea particularmente difícil debido a las grandes diferencias en los comportamientos de fragmentación de las diferentes isoformas y al hecho de que los estándares químicos puros no están disponibles en una variedad lo suficientemente grande como para definir los valores de compensación. Otra limitación es que el proceso ESI genera inevitablemente artefactos, lo que resulta en la generación artificial de picos para algunos lípidos como DAG, Pas y FA, lo que puede conducir a una cuantificación errónea.

A continuación, resumimos las partes más críticas del protocolo en función de nuestra experiencia. El primero está relacionado con el hecho de que cada tipo de tejido de ratón tiene un perfil lipídico único en términos de cantidad de lípidos y proporciones de clase. Con esto, las cantidades iniciales del tejido basadas en el contenido total de proteína antes de la extracción deben determinarse cuidadosamente para no saturar la señal de MS y no abandonar el rango de cuantificación dinámica debido a la agregación de lípidos a altas concentraciones³³ o, en el extremo opuesto, para proporcionar suficiente señal de MS para cubrir los principales compuestos lipídicos para cada clase de lípidos.

El segundo aspecto crítico es garantizar una alineación adecuada de la posición de la salida del chip de nanofuente de infusión directa con el capilar de transferencia del espectrómetro de masas. Teniendo en cuenta que la calibración completa del espectrómetro de masas en ambos modos se realiza semanalmente, el intercambio entre la fuente de calibración y la configuración del chip de nanofuente puede ser la razón de una variabilidad dramática en la intensidad de la señal debido a la desalineación durante la instalación.

Otra parte crítica del protocolo es el manejo cuidadoso de la mezcla estándar interna. Como esta mezcla contiene una cantidad significativa de diclorometano, una vez abierta, debe consumirse rápidamente para evitar un almacenamiento prolongado y múltiples usos que conducen a la evaporación y al cambio artificial de concentración. Además, es importante una manipulación coherente de la mezcla patrón después de la retirada del almacenamiento a -20 °C, ya que las diferencias de temperatura pueden dar lugar a inconsistencias de volumen durante el pipeteo con pipetas de colchón de aire. Una opción sería reemplazar el diclorometano en el tampón de resuspensión estándar con metanol puro, lo que podría mejorar la conveniencia de manejo, pero podría afectar negativamente la solubilidad de algunas clases de lípidos y, por lo tanto, disminuir la precisión de cuantificación para estas clases de lípidos.

La última parte crítica es el procesamiento de datos. El flujo de trabajo de procesamiento de datos combina la conversión del software Peak by Peak del formato .raw a .mzML, aplicando el promedio de escaneo MS2 y la filtración de ruido MS1 y MS2, así como la selección de picos y la compresión de datos. Como alternativa, el software Proteowizard también se puede utilizar para la conversión de datos, pero, en este caso, varias configuraciones en LipidXplorer deben definirse manualmente. Toda la complejidad de la lipidómica de escopeta se concentra particularmente en el paso de deconvolución de los espectros de inyección directa MS1 y MS2. El software de código abierto LipidXplorer importa los espectros convertidos del formato de archivo mzML en función de la precisión de masa, la resolución de masa y la pendiente de su cambio con el aumento de m / z. El software combina múltiples espectros individuales de MS y MS / MS adquiridos dentro de una ejecución de análisis. Después, alinea picos individuales dentro de diferentes ejecuciones de muestra y, en cada grupo de picos alineados, reemplaza sus masas con su masa promedio ponderada de intensidad única, mientras que sus abundancias en cada archivo de datos permanecen intactas. Las masas representativas de grupos de picos alineados y las intensidades de pico individuales se almacenan en una base de datos de escaneo maestro. La base de datos de exploración maestra contiene todos los espectros MS1 y MS2 generados para todas las muestras del lote y se puede decontorsionar a las identificaciones de lípidos mediante consultas escritas en el lenguaje de consulta de fragmentación molecular (MFQL).

En general, el método cubre la identificación de lípidos DAG, TAG y SE basados en modo positivo y lípidos PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC y LPE basados en la adquisición en modo negativo. Durante la identificación de lípidos, se realiza la corrección isotópica para MS1 y MS2, y las intensidades ajustadas se informan en el archivo de salida de .xlsx. Alternativamente, varios otros programas están disponibles para procesar datos de escopeta, como ALEX⁴⁵ y LipidHunter⁴⁶.

Los ácidos grasos, los principales componentes de la membrana nuclear y celular, se almacenan en forma de fosfolípidos para su posterior conversión en moléculas bioactivas. Pueden ser convertidos por enzimas lisofosfolípidas aciltransferasas en lisofosfolípidos a través de la vía de Lands⁴⁷. Se sabe que la enzima LPCAT3, por ejemplo, muestra una alta especificidad para incorporar AA en los intermediarios de lisofosfatidilcolina y lisofosfatidilserina. La expresión relativamente alta de estas enzimas fue reportada dentro de células inflamatorias, como macrófagos alveolares y células epiteliales bronquiales⁴⁷, lo que lleva a la liberación de mayores proporciones relativas de fosfolípidos que contienen AA en esas células. Sin embargo, después de su liberación de los fosfolípidos de membrana por la fosfolipasa A2, la conversión de AGPI en varios tipos de mediadores lipídicos es catalizada por muchas enzimas⁴⁸. Además, estos AGPI pueden convertirse en el sustrato para la producción de prostaglandinas proinflamatorias y antiinflamatorias a través de la acción de las enzimas ciclooxigenasa (COX)-1 y COX-2⁴⁷. Los fosfolípidos son una de las fuentes de mediadores lipídicos liberados en lugares particulares donde se requiere que estos mediadores demuestren sus efectos biológicos.

El pulmón es un órgano complejo que comprende múltiples tipos de células, cada una desempeñando funciones superpuestas y de nicho para facilitar el desarrollo y la función pulmonar normal. Solo se han realizado unos pocos estudios para aislar y perfilar diferentes tipos de células en el pulmón de ratón o humano (p. ej., células alveolares tipo 2)^49,50; No se han caracterizado otros tipos importantes de células pulmonares. Otro estudio interesante⁵¹ se llevó a cabo para aislar y realizar análisis lipídicos de células inmunes endoteliales, epiteliales, mesenquimales y mixtas en el pulmón del ratón. Se observó que la concentración de AGPI incorporada en PCO y PG se enriqueció en las células inmunes. Teniendo en cuenta el hecho de que el SC induce un aumento de las células inmunes dentro del pulmón (4-5 veces), según lo evaluado por el lavado broncoalveolar (BAL)⁵², los cambios lipídicos totales observados en este estudio podrían explicarse por un aumento acumulativo en el reclutamiento de células inmunes en el pulmón del ratón.

En conclusión, la distorsión observada de ácidos grasos monoinsaturados y AGPI incorporados en fosfolípidos puede reflejar el exceso de ciertos AF dentro de la célula y / o constituir un recurso intracelular de precursores de oxilipina que se producen en exceso bajo estrés oxidativo y condiciones inflamatorias. Sin embargo, los datos adicionales sobre EPA, DHA y otras oxilipinas libres son esenciales para aclarar este punto y están fuera del alcance de la aplicación del método actual.