Создание органоидов из человеческих зубов в качестве мощного инструмента для механистических исследований и регенеративной терапии

Зубы играют важную роль в жевании пищи, речи и психологическом благополучии (самооценке). Зуб человека состоит из высокоминерализованных тканей различной плотности и твердости¹. Зубная эмаль, основной компонент коронки зуба, является самой высокой минерализованной тканью в организме человека. Во время образования эмали (амелогенеза), когда развиваются зубы, зубные эпителиальные стволовые клетки (DESC) дифференцируются в эмалообразующие клетки (амелобласты). После образования эмаль редко восстанавливается или обновляется из-за апоптотической потери амелобластов в начале прорезывания зуба¹. Восстановление поврежденной ткани эмали, вызванной травмой или бактериальным заболеванием, в настоящее время осуществляется с использованием синтетических материалов; тем не менее, они обеспокоены важными недостатками, такими как микроразрыв, нижняя остеоинтеграция и крепление, конечная продолжительность жизни и отсутствие полностью функционального ремонта². Следовательно, прочная и надежная культура человеческих DESC, обладающих способностью генерировать амелобласты и потенциалом для производства минерализованной ткани, станет важным шагом вперед в области регенеративной области зубов.

Знания о фенотипе DESC человека и биологической функции скудны ^3,4,5. Интересно, что DESC человеческих зубов были предложены для существования в остатках эпителиальных клеток Малассеза (ERM), клеточных кластерах, присутствующих в зубном фолликуле (DF), который окружает неразъединенные зубы и остается присутствующим в периодонтальной связке вокруг корня после прорезывания зуба¹. Было обнаружено, что клетки ERM, культивируемые совместно с пульпой зуба, дифференцируются в амелобластоподобные клетки и генерируют эмалеобразную ткань⁶. Однако глубокие исследования специфической роли ERM-клеток в генерации эмали (re-) были ограничены из-за отсутствия надежных моделей исследования⁷. Современные системы культивирования ERM in vitro затруднены ограниченной продолжительностью жизни и быстрой потерей фенотипа в 2D-условиях, стандартно используемых 8,9,10,11,12. Следовательно, крайне необходима разрешимая система in vitro для добросовестного расширения, изучения и дифференциации человеческих DESC.

В течение последнего десятилетия мощная техника выращивания эпителиальных стволовых клеток in vitro была успешно применена к нескольким типам (человеческих) эпителиальных тканей для изучения их биологии, а также заболеваний 13,14,15,16. Эта технология позволяет тканевым эпителиальным стволовым клеткам самостоятельно развиваться в 3D-клеточные конструкции (то есть органоиды) при посеве во внеклеточный матрикс (ECM), имитирующий каркас (обычно Matrigel), и культивируемый в определенной среде, реплицирующей нишу стволовых клеток ткани, сигнализирующую и / или эмбриогенез. Типичные факторы роста, необходимые для развития органоидов, включают эпидермальный фактор роста (EGF) и активаторы сайта интеграции MMTV бескрылого типа (WNT) 14,15,16. Полученные органоиды характеризуются длительной точностью в имитации оригинальных эпителиальных стволовых клеток ткани, а также высокой расширяемостью при сохранении их фенотипа и функциональных свойств, тем самым преодолевая часто ограниченную первичную доступность тканей человека, приобретенную в клинике. Для установления органоидов выделение эпителиальных стволовых клеток из гетерогенной ткани (т.е. содержащей другие типы клеток, таких как мезенхимальные клетки) до культивирования не требуется, поскольку мезенхимальные клетки не прикрепляются или не процветают в ECM, что в конечном итоге приводит к чисто эпителиальным органоидам 13,16,17,18,19 . Эта многообещающая и универсальная технология привела к разработке многообразных органоидных моделей из различных эпителиальных тканей человека. Однако органоиды человеческого происхождения, ценные для глубокого изучения развития, регенерации и заболеваний зубов, еще не были установлены^20,21. Недавно нам удалось разработать такую новую органоидную модель, начиная с DF-ткани из третьих моляров (зубов мудрости), удаленных у пациентов подросткового возраста¹⁹.

Здесь мы описываем протокол развития эпителиальных органоидных культур из взрослого человеческого зуба (т.е. из DF третьих моляров) (рисунок 1A). Результирующие органоиды экспрессируют ERM-ассоциированные маркеры стволовости, будучи при этом долгосрочными расширяемыми. Интересно, что в отличие от большинства других органоидных моделей, обычно необходимый EGF является избыточным для устойчивого развития и роста органоидов. Интересно, что органоиды ствола проявляют свойства дифференцировки амелобласта, тем самым имитируя особенности и процессы ERM/DESC, происходящие in vivo. Новая и уникальная органоидная модель, описанная здесь, позволяет исследовать биологию, пластичность и дифференциацию DESC и открывает двери для первых шагов к зубо-регенеративным подходам.