Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa

Os dentes têm papéis essenciais na mastigação alimentar, fala e bem-estar psicológico (autoimagem). O dente humano consiste em tecidos altamente mineralizados de densidade e dureza^{variadas 1}. O esmalte dentário, o principal componente da coroa dentária, é o tecido mineralizado mais alto do corpo humano. Durante a formação do esmalte (amelogênese), quando os dentes se desenvolvem, as células-tronco epiteliais dentárias (DESCs) se diferenciam em células formadoras de esmalte (ameloblasts). Uma vez formado, o esmalte raramente é reparado ou renovado devido à perda apoptótica dos ameloblastas no início da erupção dentária¹. A restauração do tecido esmalte danificado, causado por trauma ou doença bacteriana, é atualmente realizada com materiais sintéticos; no entanto, estes são incomodados com deficiências importantes como microleakage, osseointegração e ancoragem inferiores, vida útil finita e falta de reparo totalmente funcional². Assim, uma cultura robusta e confiável de DESCs humanos com capacidade para gerar ameloblasts e potencial para produzir tecido mineralizado seria um grande avanço no campo regenerativo dental.

O conhecimento sobre fenótipo e função biológica do DESC humano são escassos ^3,4,5. Curiosamente, foram propostos DESCs de dentes humanos para existir nos Repousos de Célula Epitelial de Malassez (ERM), aglomerados celulares presentes dentro do folículo dentário (DF), que circunda dentes não rompidos, e permanece presente no ligamento periodontal ao redor da raiz uma vez que o dente entra em erupção¹. Células ERM co-cultivadas com polpa dentária foram encontradas para se diferenciar em células semelhantes ao ameloblast e gerar tecido semelhante ao esmalte⁶. No entanto, estudos profundos sobre o papel específico das células ERM na geração de esmalte (re-) foram limitados devido à falta de modelos de estudo confiáveis⁷. Os sistemas atuais de cultura in vitro ERM são dificultados pela vida útil limitada e perda rápida de fenótipo nas condições 2D usadas standardmente 8,9,10,11,12. Assim, é fortemente necessário um sistema in vitro tratável para expandir, estudar e diferenciar deSCs humanos.

Durante a última década, uma técnica poderosa para cultivar células-tronco epiteliais in vitro foi aplicada com sucesso a vários tipos de tecidos epiteliais (humanos) para estudar sua biologia, bem como a doença 13,14,15,16. Essa tecnologia permite que as células-tronco epiteliais do tecido se auto-desenvolvam em construções de células 3D (ou seja, organoides) quando semeadas em uma matriz extracelular (ECM) -imitando andaimes (tipicamente, Matrigel) e cultivadas em um meio definido replicando a sinalização do nicho de células-tronco do tecido e/ou embriogênese. Os fatores típicos de crescimento necessários para o desenvolvimento organoide incluem fator de crescimento epidérmico (EGF) e ativadores de integração MMTV do tipo wingless (WNT) 14,15,16. Os organoides resultantes são caracterizados pela fidelidade duradoura na imitação das células-tronco epiteliais originais do tecido, bem como alta expansão, mantendo seu fenótipo e propriedades funcionais, superando assim a disponibilidade de tecido humano primário muitas vezes limitada como adquirido da clínica. Para estabelecer organoides, o isolamento das células-tronco epitelial do tecido heterogêneo (ou seja, compreendendo outros tipos de células, como células mesenquimais) antes da cultivo não é necessário, pois as células mesenquimais não se ligam ou prosperam no ECM, eventualmente resultando em organoides puramente epiteliais 13,16,17,18,19 . Esta tecnologia promissora e versátil levou ao desenvolvimento de modelos organoides múltiplos de vários tecidos epiteliais humanos. No entanto, os organoides derivados do dente humano, valiosos para o estudo profundo do desenvolvimento dentário, regeneração e doenças, ainda não foram estabelecidos^20,21. Recentemente conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido DF a partir de terceiros molares (dentes do siso) extraídos de pacientes adolescentes¹⁹.

Aqui, descrevemos o protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano adulto (ou seja, do DF do terceiro molar) (Figura 1A). Os organoides resultantes expressam marcadores de haste associados ao ERM, sendo expansíveis a longo prazo. Curiosamente, ao contrário da maioria dos outros modelos organoides, o EGF tipicamente necessário é redundante para o desenvolvimento e crescimento organoide robusto. Curiosamente, os organoides de caule apresentam propriedades de diferenciação de ameloblast, imitando características e processos do ERM/DESC que ocorrem in vivo. O novo e único modelo organoide descrito aqui permite explorar a biologia, plasticidade e capacidade de diferenciação do DESC e abre as portas para dar os primeiros passos em direção a abordagens regenerativas dentárias.