Нейтронная спектроскопия высокого разрешения для исследования пикосекундно-наносекундной динамики белков и гидратационной воды

Нейтрон представляет собой массивную частицу без заряда, которая на протяжении многих лет успешно использовалась для зондирования образцов в различных областях от фундаментальной физики до биологии¹. Для биологических применений широко используются малоугловое рассеяние нейтронов, неупругое рассеяние нейтронов, а также нейтронная кристаллография и рефлектометрия ^2,3,4. Неупругое рассеяние нейтронов обеспечивает усредненное по ансамблю измерение динамики, не требующее специфической маркировки как таковой, и качество сигнала, которое не зависит от размера или белка⁵. Измерение может быть выполнено с использованием очень сложной среды для исследуемого белка, которая имитирует внутриклеточную среду, такую как дейтерированный бактериальный лизат или даже in vivo ^3,6,7. Для изучения динамики могут быть использованы различные экспериментальные установки, а именно: i) доступ к динамике суб-ps-ps, дающий время пролета, ii) доступ к динамике ps-ns, дающий обратное рассеяние, и iii) спин-эхо-дающий доступ к динамике от нс до сотен нс. Обратное рассеяние нейтронов использует закон Брэгга 2d sinθ = nλ, где d — расстояние между плоскостями в кристалле, θ — угол рассеяния, n — порядок рассеяния и λ — длина волны. Использование кристаллов для обратного рассеяния по направлению к детекторам позволяет достичь высокого разрешения по энергии, обычно ~ 0,8 мкВ. Для измерения энергообмена используется либо доплеровский привод, несущий кристалл в обратном рассеянии, для определения и настройки входящей длины волны ^{нейтрона 8,9,10} (рис. 1), либо времяпролетная установка может быть использована за счет уменьшения энергетического разрешения ¹¹.

Рисунок 1: Эскиз спектрометра обратного рассеяния нейтронов с доплеровским приводом. Входящий луч попадает на прерыватель⁴² преобразования фазового пространства (PST), который увеличивает поток в положении образца. Затем он обратно рассеивается по направлению к образцу доплеровским приводом, который выбирает энергию E₁ (голубая стрелка). Затем нейтроны рассеиваются образцом (с различными энергиями, представленными цветом стрелок), и анализаторы, изготовленные из кристаллов Si 111, будут рассеивать только нейтроны с определенной энергией E₀ (здесь красные стрелки). Следовательно, передача импульса q получается из обнаруженного положения нейтрона на матрице детекторов, а передача энергии получается из разности E₁ – E₀. Время пролета, ожидаемое для нейтронного импульса, создаваемого PST, используется для отбрасывания сигнала от нейтронов, рассеянных непосредственно к детекторным трубкам. Аббревиатура: PST = преобразование фазового пространства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для спектроскопии обратного рассеяния основной вклад в сигнал от образцов, богатых протонами водорода, таких как белки, приходится на некогерентное рассеяние, для которого интенсивность рассеяния S_inc(q, ω) показана уравнением (1)¹²

(1)

Где σ_inc — некогерентное поперечное сечение рассматриваемого элемента, k’ — норма рассеянного волнового вектора, k — норма входящего волнового вектора, q (= k – k’) — передача импульса, r j(t) — вектор положения атома _j в момент времени t, а ω — частота, соответствующая переносу энергии между входящим нейтроном и системой. Угловые скобки обозначают среднее значение ансамбля. Следовательно, некогерентное рассеяние исследует усредненную по ансамблю самокорреляцию положений атомов во времени и дает самодинамику, усредненную по всем атомам в системе и различным временным началам (среднее значение ансамбля). Функция рассеяния является преобразованием Фурье во времени промежуточной функции рассеяния I(q, t), которое можно рассматривать как преобразование Фурье в пространстве корреляционной функции Ван Хова, показанное уравнением (2):

(2)

Где ρ(r,t) — плотность вероятности нахождения атома в положении r и времени t ¹³.

Для фиковского диффузионного процесса функция самодиффузии возникает (см. Eq (3)) после двойного преобразования Фурье в функции рассеяния, состоящей из лоренциана ширины линии, заданной γ = Dq².

(3)

Были разработаны и признаны полезными более сложные модели, такие как модель скачкообразной диффузии Сингви и Шёландера для внутренней динамики белка^{ps-ns 14} или модель вращения Sears для гидратационной воды^15,16,17.

На приборе обратного рассеяния нейтронов (NBS) IN16B ^8,9 в ILL, Гренобль, Франция (дополнительный рисунок S1), установка, обычно используемая с белками, состоит из кристаллов Si 111 для анализаторов с доплеровским приводом для настройки входящей длины волны (дополнительный рисунок S2A), тем самым предоставляя доступ к диапазону передачи импульса ~ ^0,2 Å-1 < q < ~ 2 ^Å-1 и диапазону передачи энергии ^–30 мкэВ < < 30 мкэВ, что соответствует временным шкалам в диапазоне от нескольких пс до нескольких нс и расстояний в несколько Å. Кроме того, IN16B предлагает возможность выполнять упругое и неупругое сканирование с фиксированным окном (E/IFWS)¹⁰, которое включает сбор данных при фиксированной передаче энергии. Поскольку поток ограничен при работе с нейтронами, E/IFWS позволяет максимизировать поток для одной передачи энергии, тем самым сокращая время сбора данных, необходимое для получения удовлетворительного отношения сигнал/шум. Более поздним вариантом является режим¹¹ спектрометра обратного рассеяния и времяпролетного спектрометра (BATS), который позволяет измерять широкий диапазон переносов энергии (например, -150 мкВ < < 150 мкВ) с более высоким потоком, чем с доплеровским приводом, но за счет более низкого энергетического разрешения (дополнительный рисунок S2B).

Важным свойством рассеяния нейтронов является то, что некогерентное поперечное сечение σ_{включительно} имеет в 40 раз более высокое значение для водорода, чем для дейтерия, и пренебрежимо мало для других элементов, обычно встречающихся в биологических образцах. Следовательно, динамика белков в жидкой среде может быть изучена с использованием дейтерированного буфера, а состояние порошка позволяет изучать либо внутреннюю динамику белка с гидрогенизированным протеиновым порошком, гидратированным с_D2O, либо исследование гидратационной воды для пердейтерированного протеинового порошка, гидратированного с H₂O. В жидком состоянии обратное рассеяние нейтронов обычно позволяет одновременно получить доступ к самодиффузии белков в центре масс (диффузия фиковского типа) и их внутренней динамике. Последние представляют собой движения основной цепи и боковой цепи, обычно описываемые так называемой скачкообразной диффузионной моделью или другими ^3,18. В гидрогенизированных протеиновых порошках диффузия белка отсутствует и необходимо моделировать только внутреннюю динамику. Для гидратационной воды вклад поступательных и вращательных движений молекул воды представляет различную зависимость от передачи импульса q, что позволяет различать их в процессе анализа данных¹⁷.

Эта работа иллюстрирует метод обратного рассеяния нейтронов с изучением белков, которые, как было установлено, способны разворачиваться, агрегироваться в каноническую форму, состоящую из стопок β-нитей – так называемого перекрестного β паттерна^19,20 – и образовывать удлиненные волокна. Это так называемая амилоидная агрегация, которая широко изучается из-за ее центральной роли в нейродегенеративных расстройствах, таких как болезни Альцгеймера или Паркинсона^21,22. Изучение амилоидных белков также мотивировано функциональной ролью, которую они могут играть ^23,24, или их высоким потенциалом для разработки новых биоматериалов²⁵. Физико-химические детерминанты агрегации амилоида остаются неясными, и нет общей теории агрегации амилоида, несмотря на огромный прогресс за последние^{годы 21,26}.

Агрегация амилоида подразумевает изменения структуры и стабильности белка с течением времени, изучение которых, естественно, подразумевает динамику, связанную со стабильностью конформации белка, функцией белка и энергетическим ландшафтом^{белка 27}. Динамика напрямую связана со стабильностью определенного состояния через энтропийный вклад для самых быстрых движений²⁸, и функция белка может поддерживаться движениями в различных временных масштабах от суб-пс для светочувствительных белков²⁹ до мс для доменных движений, что может быть облегчено пикосекундно-наносекундной динамикой³⁰.

Будут представлены два примера использования спектроскопии обратного рассеяния нейтронов для изучения амилоидных белков: один в жидком состоянии для изучения динамики белка и один в гидратированном порошковом состоянии для изучения динамики гидратационной воды. Первый пример касается агрегации лизоцима в сферы размером мкм (называемые частицами), за которой следуют в режиме^{реального времени 5}, а второй – сравнение динамики воды в нативном и агрегированном состояниях человеческого белка тау-31.

Лизоцим является ферментом, участвующим в иммунной защите и состоит из 129 аминокислотных остатков. Лизоцим может образовывать твердые частицы в дейтерированном буфере при pD 10,5 и температуре 90 °C. С помощью рассеяния нейтронов мы показали, что временная эволюция коэффициента диффузии лизоцима в центре масс следует за одной экспоненциальной кинетикой флуоресценции тиофлавина Т (флуоресцентный зонд, используемый для мониторинга образования амилоидных перекрестных β паттернов³²), что указывает на то, что образование сверхструктур частиц и перекрестных β происходит за один шаг с одинаковой скоростью. Более того, внутренняя динамика оставалась постоянной на протяжении всего процесса агрегации, что можно объяснить либо быстрым конформационным изменением, которое невозможно наблюдать на приборах NBS, либо отсутствием существенного изменения внутренней энергии белка при агрегации.

Человеческий белок тау представляет собой внутренне неупорядоченный белок (IDP), состоящий из 441 аминокислоты для так называемой изоформы 2N4R, которая, в частности, участвует в болезни Альцгеймера³³. Используя обратное рассеяние нейтронов на порошках пердейтерированного белка тау, мы показали, что динамика гидратационной воды увеличивается в состоянии волокна с более высокой популяцией молекул воды, претерпевающих поступательные движения. Результат свидетельствует о том, что увеличение энтропии гидратации воды может привести к фибрилляции амилоида тау.