タンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクスを研究するための高分解能中性子分光法

中性子は電荷のない巨大な粒子であり、基礎物理学から生物学まで、さまざまな分野のサンプルを調べるために長年にわたって成功裏に使用されてきました¹。生物学的用途では、小角中性子散乱、非弾性中性子散乱、中性子結晶構造解析および反射率測定が広く使用されています^2,3,4。非弾性中性子散乱は、特定の標識自体を必要とせずにダイナミクスのアンサンブル平均測定を提供し、サイズ^{やタンパク質に依存し}ない信号品質を提供します5。測定は、重水素化細菌ライセートやin vivoなどの細胞内培地を模倣する研究中のタンパク質の非常に複雑な環境を使用して行うことができます^3,6,7。ダイナミクス、すなわち、i)飛行時間によるサブps-psダイナミクスへのアクセス、ii)後方散乱によるps-nsダイナミクスへのアクセス、iii)nsから数百nsまでのダイナミクスへのアクセスなど、さまざまな実験セットアップを使用してダイナミクスを研究することができます。中性子後方散乱は、ブラッグの法則2d sinθ = nλを利用しており、dは結晶内の平面間の距離、θは散乱角、nは散乱次数、λは波長です。検出器への後方散乱に結晶を使用することで、エネルギーの高分解能(通常~0.8μeV)を達成することができます。エネルギー交換を測定するには、後方散乱で結晶を運ぶドップラードライブを使用して入射中性子波長^8、9、10を定義および調整するか(図1)、エネルギー分解能の低下を犠牲にして飛行時間型セットアップを使用できます¹¹。

図1:ドップラー駆動の中性子後方散乱分光計のスケッチ。入射ビームは位相空間変換(PST)チョッパ⁴²に当たり、試料位置における磁束を増加させる。次に、ドップラードライブによってサンプルに向かって後方散乱され、ドップラードライブは_{エネルギーE1}(シアンの矢印)を選択します。次に、中性子はサンプルによって散乱され(矢印の色で表される異なるエネルギーで)、Si 111結晶で作られた分析装置は、特定のエネルギーE₀(ここでは赤い色の矢印)の中性子のみを後方散乱します。したがって、運動量移動qは検出器アレイ上の中性子の検出位置から得られ、エネルギー移動は差_E1-E0から得られます。PSTによって生成された中性子パルスに予想される飛行時間は、検出器管に向かって直接散乱された中性子からの信号を破棄するために使用されます。略語:PST =位相空間変換。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

後方散乱分光法では、タンパク質などの水素プロトンに富むサンプルからのシグナルへの主な寄与は、散乱強度S_inc(q、ω)が式(1)¹²で示されるインコヒーレント散乱から来ています

(1)

ここでσ_incは考慮される元素のインコヒーレント断面であり、k’は散乱波ベクトルのノルム、kは入射波ベクトルのノルム、q(= k – k’)運動量移動、r j(t)時間tにおける原子_jの位置ベクトル、ωは入射中性子と系との間のエネルギー移動に対応する周波数である。角括弧はアンサンブル平均を示します。したがって、インコヒーレント散乱は、原子位置のアンサンブル平均単粒子自己相関を時間とプローブし、システム内のすべての原子と異なる時間起源(アンサンブル平均)で平均化された自己ダイナミクスを提供します。散乱関数は、中間散乱関数 I(q, t) のときのフーリエ変換であり、式 (2) で示されるファンホーブ相関関数の空間でのフーリエ変換と見なすことができます。

(2)

ここで、ρ(r,t)は、位置rと時間^t13で原子を見つける確率密度です。

フィッキアン拡散過程の場合、自己拡散関数は、γ = Dq²で与えられる線幅のローレンツ分布からなる散乱関数の二重フーリエ変換の後に生じます(式(3)を参照)。

(3)

より洗練されたモデルが開発され、ps-ns内部タンパク質ダイナミクス¹⁴のSingwiとSjölanderによるジャンプ拡散モデルや、水和水15,16,17のSearsによる回転モデルなど、有用であることがわかりました。

フランスのグルノーブルにあるILLの中性子後方散乱(NBS)装置IN16B ^8,9(補足図S1)では、タンパク質で一般的に使用されるセットアップは、入射波長を調整するためのドップラードライブを備えたアナライザー用のSi 111結晶で構成され(補足図S2A)、それによって運動量伝達範囲~0.2 Å-1 < q < ~2 ^Å-1および^–30 μeVのエネルギー伝達範囲にアクセスできます< < 30μeV-数psから数nsの範囲のタイムスケールと数Åの距離に対応します。さらに、IN16Bは、固定エネルギー伝達でのデータ収集を含む弾性および非弾性固定ウィンドウスキャン(E/IFWS)¹⁰を実行する可能性を提供します。中性子を扱う場合、磁束が制限されるため、E/IFWSは1回のエネルギー伝達で磁束を最大化できるため、満足のいく信号対雑音比を得るために必要な取得時間を短縮できます。より最近のオプションは、後方散乱および飛行時間型分光計(BATS)モード¹¹であり、ドップラー駆動よりも高い磁束で、広範囲のエネルギー移動(例えば、-150μeV<< 150μeV)の測定を可能にしますが、エネルギー分解能は低くなります(補足図S2B)。

中性子散乱の重要な特性は、インコヒーレント断面積σ_incが水素に対して重水素よりも40倍高い値を持ち、生物学的サンプルに一般的に見られる他の元素に対しては無視できることです。したがって、液体環境におけるタンパク質の動態は、重水素化緩衝液を用いて研究することができ、粉末状態は、D2Oで水和した水素化タンパク質粉末によるタンパク質内部動態の研究、または_H2Oで水和した過重化タンパク質粉末の水和水の研究を可能にする。液体状態では、中性子後方散乱は通常、タンパク質の重心自己拡散(フィッキアン型拡散)とその内部ダイナミクスに同時にアクセスすることができます。後者は、通常、いわゆるジャンプ拡散モデルなどによって記述されるバックボーンおよびサイドチェーン運動です^3,18。水素化タンパク質粉末では、タンパク質の拡散は存在せず、内部ダイナミクスのみをモデル化する必要があります。水和水の場合、水分子の並進運動および回転運動の寄与は、運動量移動qに対して異なる依存性を示し、これは、データ分析プロセスにおけるそれらの区別を可能にする¹⁷。

この論文は、β鎖のスタックからなる標準的な形に展開し、凝集し、いわゆるクロスβパターン^19,20-そして細長い繊維を形成することができることが判明したタンパク質の研究による中性子後方散乱法を示しています。これはいわゆるアミロイド凝集であり、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患における中心的な役割のために広く研究されています^21,22。アミロイドタンパク質の研究は、それらが果たすことができる機能的役割^23,24または新規生体材料の開発のためのそれらの高い可能性によっても動機付けられています²⁵。アミロイド凝集の物理化学的決定要因は依然として不明であり、過去数年間の驚異的な進歩にもかかわらず、アミロイド凝集の一般理論は利用できません^21,26。

アミロイド凝集は、タンパク質の構造と経時的な安定性の変化を意味し、その研究は当然、タンパク質の立体構造安定性、タンパク質機能、およびタンパク質エネルギーランドスケープに関連するダイナミクスを意味します²⁷。ダイナミクスは、最速の運動²⁸のエントロピー寄与を通じて特定の状態の安定性に直接関連しており、タンパク質の機能は、光感受性タンパク質²⁹ のサブpsからドメイン運動のmsまで、ピコ秒-ナノ秒のダイナミクス³⁰によって促進されるさまざまなタイムスケールの運動によって維持できます。

中性子後方散乱分光法を使用してアミロイドタンパク質を研究する2つの例、1つはタンパク質のダイナミクスを研究するための液体状態、もう1つは水和水のダイナミクスを研究するための水和粉末状態の2つの例を紹介します。第1の例は、リゾチームのμmサイズの球体(微粒子と呼ばれる)への凝集に関するものであり、続いてリアルタイムで5、第²の例は、ヒトタンパク質タウ³¹の天然状態および凝集状態における水動態の比較に関するものである。

リゾチームは免疫防御に関与する酵素で、129個のアミノ酸残基で構成されています。リゾチームは、pD10.5および90°Cの温度で重水素化緩衝液中で微粒子を形成することができます。 中性子散乱により、リゾチームの重心拡散係数の時間発展がチオフラビンT蛍光(アミロイド交差βパターンの形成をモニターするために使用される蛍光プローブ³²)の単一の指数関数的速度論に従うことを示し、粒子形成上部構造と交差βパターンが同じ速度で1つのステップで発生することを示しています。さらに、内部ダイナミクスは凝集プロセス全体を通して一定であり、これはNBS装置では観察できない速い立体構造変化、または凝集時にタンパク質の内部エネルギーに大きな変化がないことによって説明できます。

ヒトタンパク質タウは、いわゆる2N4Rアイソフォームの441アミノ酸からなる天然変性タンパク質(IDP)であり、アルツハイマー病に特に関与しています³³。過重水素化タンパク質タウの粉末に対する中性子後方散乱を用いて、繊維状態で水和水ダイナミクスが増加し、並進運動を受ける水分子の集団が多いことを示しました。この結果は、水和水エントロピーの増加がタウのアミロイド細動を引き起こす可能性があることを示唆している。