Протеомика масс-спектрометрии под контролем клеточных линий у развивающегося эмбриона (лягушки)

Наше понимание дифференцировки клеток и генезиса тканей и органов является результатом десятилетий сложных целевых скринингов генов и их продуктов. Расширение наших знаний обо всех биомолекулах и их количествах во время важных клеточных событий поможет разгадать молекулярные механизмы, которые контролируют пространственную и временную структуру плана тела позвоночных. Технологии, обеспечивающие молекулярную амплификацию и секвенирование, теперь могут регулярно сообщать о большом количестве генов и транскриптов, поддерживая исследования, основанные на гипотезах, в фундаментальных биологических и трансляционных исследованиях. Чтобы понять развивающиеся системы, сложная взаимосвязь между транскрипцией и трансляцией требует прямого анализа нескольких белков и их посттрансляционных модификаций. Глобальная протеомика с использованием биологических систем in vitro, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, начала очерчивать механизмы тканевой индукции ^1,2. У сложных организмов, таких как эмбрион позвоночных, развитие зависит от градиентов морфогена в контексте пространства и времени³. Из этого следует, что получение знаний о протеомных изменениях по мере того, как клетки дифференцируются с образованием специализированных тканей, таких как нервные ткани, дает ключ к разблокированию молекулярных программ, контролирующих нормальное и дефектное развитие, и направляет терапию следующего поколения.

Позвоночная южноафриканская когтистая лягушка (Xenopus laevis) является хорошо зарекомендовавшей себя моделью в клеточной и развивающейся, нейро- и регенеративной биологии. Нобелевская премия сэра Джона Гердона по физиологии и медицине 2012 года ^4,5 за открытие плюрипотентности соматического ядра подчеркнула важность этой модели для открытий в фундаментальных и трансляционных исследованиях. Эмбрионы Xenopus развиваются внешне по отношению к матери, тем самым облегчая прямое манипулирование клетками, клеточными клонами и экспрессией генов на различных стадиях развития. Асимметричная пигментация и стереотипное деление клеток позволили составить карту воспроизводимых карт судьбы ^16-6 и 32-клеточного^{эмбриона на 7,8} стадии. Для протеомики на основе масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS) дополнительные преимущества модели включают относительно большой размер (~1 мм в диаметре), что дает обильное содержание белка для анализа (~130 мкг у эмбрионов на ранней стадии расщепления, ~10 мкг белка в одиночных клетках 16-клеточного эмбриона)^9,10.

В настоящее время HRMS является ведущей технологией выбора для обнаружения белков. Эта технология позволяет прямо, чувствительно и специфически обнаруживать и количественно определять множественные, обычно от сотен до тысяч различных^{белков11}. Восходящая протеомика HRMS включает в себя ряд взаимосвязанных этапов. После экстракции из образца клетки / ткани белки перевариваются протеолитическим ферментом, таким как трипсин (восходящая протеомика). Полученные пептиды разделяют на основе их различных физико-химических свойств, включая гидрофобность (обращенно-фазовая жидкостная хроматография, LC), суммарный заряд (ионообменная хроматография), размер (эксклюзионная хроматография) или электрофоретическую подвижность (капиллярный электрофорез, CE). Затем пептиды заряжаются (ионизируются), как правило, с помощью электрораспыления ионизации (ESI), а пептидные ионы обнаруживаются и секвенируются посредством газофазной фрагментации с помощью тандемной HRMS. Полученные пептидные данные сопоставляются с протеомом исследуемого организма. При том, что интенсивность сигнала пептид-ионов специфического белка (протеотипа) коррелирует с концентрацией, количественное определение белка может быть выполнено без меток или на основе меток (мультиплексирующее количественное определение). Протеомика HRMS дает богатый источник информации о молекулярном состоянии исследуемой системы, что позволяет генерировать гипотезы и проводить последующие функциональные исследования.

Рисунок 1: Пространственно-временная масштабируемая протеомика, обеспечивающая протеомику HRMS, управляемую клеточной линией, в развивающемся эмбрионе (лягушке). (A) Визуализация образца (1) с использованием стереомикроскопа (2) для инъекции идентифицированной клетки (врезка) с использованием изготовленной микропипетки (3) под контролем трансляционной стадии (4). (B) Субклеточный отбор идентифицированных левых клеток D₁₁ в 16-клеточном эмбрионе. (C) Рассечение целой клетки D₁₁ из 16-клеточного эмбриона. (D) Флуоресцентное (зеленое) отслеживание левого и правого потомства D₁₁₁ от 32-клеточного эмбриона для направления рассечения невральной эктодермы (NE) в гаструле (стадия 10) и выделения ткани-потомка от головастика с использованием FACS. Масштабные линейки: 200 мкм для эмбрионов, 1,25 мм для флакона. Рисунки были адаптированы с разрешения ссылок 15,19,21,59. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Представленный здесь протокол позволяет количественно оценить большое количество белков в идентифицированных клетках/тканях развивающихся эмбрионов X. laevis на основе HRMS. Подход основан на точной идентификации клеток, воспроизводимых картах клеточной судьбы и установленных методологиях отслеживания клеточных линий в этой биологической модели ^6,7,8. Как показано на рисунке 1, мы изучаем протеомы из отдельных клеток, используя диссекцию целых клеток или капиллярный микропробоотбор для аспирации клеточного содержимого. Наблюдение за происхождением клетки позволяет нам изучать пространственно-временную эволюцию протеома по мере того, как клетки образуют ткани во время гаструляции. Клеточное потомство флуоресцентно маркируют путем введения флуорофора, конъюгированного с инертным декстраном или мРНК для флуоресцентного белка (например, зеленого флуоресцентного белка или GFP). Меченое потомство изолируют в желаемые моменты развития. Во время гаструляции клоны клеток, которые плотно сгруппированы, могут быть выделены путем рассечения. После гаструляции клеточные клоны могут быть распределены внутри эмбриона за счет миграционных движений и могут быть выделены из диссоциированных тканей с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Белки в этих клетках и тканях измеряются с помощью восходящей протеомики с использованием ВЭЖХ или КЭ для разделения и тандемной HRMS ESI для идентификации. Протеомика HRMS, управляемая клеточными линиями, масштабируется для различных размеров клеток и линий внутри эмбриона и является специфической, чувствительной и количественной. На отдельных примерах, показанных здесь, мы также демонстрируем, что этот протокол является масштабируемым и широко адаптируемым к различным типам клеток и клеточных линий.

Рисунок 2: Биоаналитический рабочий процесс. Микродиссекция и капиллярная аспирация, или FACS, облегчают отбор проб клеточного и клонального белка. Истощение обильных белков желтка и разделение с помощью капиллярного электрофореза (CE) или нанопоточной жидкостной хроматографии (LC) с повышенной чувствительностью идентификации (ID) с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS) с помощью ионизации электрораспылением (ESI). Количественная оценка выявила дисрегуляцию, предоставив новую информацию для исследований, основанных на гипотезах, в сочетании с информацией, доступной из онтологии генов (GO). Рисунки были адаптированы с разрешения ссылки¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.