Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Ons begrip van celdifferentiatie en het ontstaan van weefsels en organen is het resultaat van tientallen jaren van uitgebreide gerichte screenings van genen en hun producten. Het vergroten van onze kennis van alle biomoleculen en hun hoeveelheden tijdens belangrijke cellulaire gebeurtenissen zou helpen bij het ontrafelen van moleculaire mechanismen die de ruimtelijke en temporele patronen van het gewervelde lichaamsplan beheersen. Technologieën die moleculaire amplificatie en sequencing mogelijk maken, zijn nu in staat om routinematig te rapporteren over grote aantallen genen en transcripten, ter ondersteuning van hypothesegestuurde studies in fundamenteel biologisch en translationeel onderzoek. Om ontwikkelende systemen te begrijpen, pleit een complexe relatie tussen transcriptie en translatie voor directe analyse van meerdere eiwitten en hun posttranslationele modificaties. Globale proteomics met behulp van in vitro biologische systemen, zoals geïnduceerde pluripotente stamcellen, begonnen mechanismen van weefselinductie^af te bakenen ^1,2. In complexe organismen, zoals het gewervelde embryo, is de ontwikkeling afhankelijk van morfogene gradiënten in de context van ruimte en tijd³. Hieruit volgt dat het verkrijgen van kennis van proteomische veranderingen naarmate cellen differentiëren om gespecialiseerde weefsels te vormen, zoals neurale weefsels, een sleutel biedt om moleculaire programma’s te ontgrendelen die de normale en defecte ontwikkeling beheersen en therapieën van de volgende generatie begeleiden.

De gewervelde Zuid-Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis) is een beproefd model in de cel- en ontwikkelings-, neuro- en regeneratieve biologie. Sir John Gurdon’s 2012 Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde ^4,5 voor de ontdekking van pluripotentie van de somatische kern benadrukte het belang van dit model voor ontdekkingen in fundamentele en translationele studies. Xenopus-embryo’s ontwikkelen zich extern voor de moeder, waardoor directe manipulatie van cellen, celklonen en genexpressie over verschillende stadia van ontwikkeling mogelijk wordt. Asymmetrische pigmentatie en stereotiepe celdelingen maakten het mogelijk om reproduceerbare lotkaarten van het 16-6 en 32-cel ^7,8 stadium embryo in kaart te brengen. Voor op hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) gebaseerde proteomics zijn bijkomende voordelen van het model een relatief grote omvang (~ 1 mm in diameter), die een overvloedig eiwitgehalte oplevert voor analyse (~ 130 μg in embryo’s in het vroege splitsingsstadium, ~ 10 μg eiwitgehalte in enkele cellen van het 16-celembryo)^9,10.

Op dit moment is HRMS de toonaangevende technologie bij uitstek voor het detecteren van eiwitten. Deze technologie maakt directe, gevoelige en specifieke detectie en kwantificering van meerdere, meestal honderden tot duizenden verschillende eiwitten^{mogelijk 11}. Bottom-up proteomics door HRMS omvat een reeks onderling verbonden stappen. Na extractie uit het cel/weefselmonster worden eiwitten verteerd met een proteolytisch enzym, zoals trypsine (bottom-up proteomics). De resulterende peptiden worden gescheiden op basis van hun verschillende fysisch-chemische eigenschappen, waaronder hydrofobiciteit (reversed-phase vloeistofchromatografie, LC), nettolading (ionenwisselingschromatografie), grootte (grootte-uitsluitingschromatografie) of elektroforetische mobiliteit (capillaire elektroforese, CE). Peptiden worden vervolgens geladen (geïoniseerd), meestal met behulp van elektrospray-ionisatie (ESI), en peptide-ionen worden gedetecteerd en gesequenced via gasfasefragmentatie door tandem HRMS. De resulterende peptidegegevens worden toegewezen aan het proteoom van het organisme dat wordt bestudeerd. Met eiwitspecifieke (proteotypische) peptide-ionsignaalintensiteit die correleert met concentratie, kan eiwitkwantificering labelvrij of labelgebaseerd (multiplexingkwantificering) worden uitgevoerd. HRMS-proteomics levert een rijke bron van informatie op over de moleculaire toestand van het bestudeerde systeem, waardoor hypothesen kunnen worden gegenereerd en functionele vervolgstudies kunnen worden uitgevoerd.

Figuur 1: Spatiotemporaal schaalbare proteomics die cel-afstamming geleide HRMS proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo mogelijk maken. (A) Visualisatie van het monster (1) met behulp van een stereomicroscoop (2) voor injectie van een geïdentificeerde cel (inzet), met behulp van een gefabriceerde micropipette (3) onder controle door een translatiestadium (4). B) Subcellulaire bemonstering van de geïdentificeerde linker D_11-cel in een embryo met 16 cellen. (C) Dissectie van een hele D_11-cel uit een embryo van 16 cellen. (D) Fluorescerende (groene) tracering van de linker en rechter D₁₁₁ nakomelingen van een 32-celig embryo om dissectie van het neurale ectoderm (NE) in de gastrula (stadium 10) en isolatie van het afstammelingsweefsel van het kikkervisje met behulp van FACS te begeleiden. Schaalstaven: 200 μm voor embryo’s, 1,25 mm voor de injectieflacon. De cijfers werden met toestemming aangepast van referenties 15,19,21,59. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het hier gepresenteerde protocol maakt hrms-gebaseerde kwantificering mogelijk van grote aantallen eiwitten in geïdentificeerde cellen / weefsels bij het ontwikkelen van X. laevis-embryo’s. De aanpak bouwt voort op nauwkeurige celidentificatie, reproduceerbare cellotkaarten en gevestigde methodologieën om cellijnen te volgen in dit biologische model ^6,7,8. Zoals te zien is in figuur 1, bestuderen we proteomen van afzonderlijke cellen door gebruik te maken van hele-celdissectie of capillaire microsampling om cellulaire inhoud te aspirateren. Het monitoren van de afstamming van een cel stelt ons in staat om de spatiotemporale evolutie van het proteoom te bestuderen als cellen weefsels vormen tijdens gastrulatie. Het celprogenaat wordt fluorescerend gemarkeerd door het injecteren van een fluorofoor geconjugeerd aan inert dextran of mRNA voor fluorescerend eiwit (bijv. Groen fluorescerend eiwit of GFP). Het gelabelde nageslacht wordt geïsoleerd op de gewenste ontwikkelingstijdstippen. Tijdens gastrulatie kunnen celklonen die strak geclusterd zijn, worden geïsoleerd door dissectie. Na gastrulatie kunnen celklonen in het embryo worden verspreid als gevolg van migratiebewegingen en kunnen ze worden geïsoleerd uit gedissocieerde weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Eiwitten in deze cellen en weefsels worden gemeten via bottom-up proteomics met HPLC of CE voor scheiding en ESI tandem HRMS voor identificatie. Cel-lineage-geleide HRMS proteomics is schaalbaar naar verschillende celgroottes en afstammingslijnen binnen het embryo en is specifiek, gevoelig en kwantitatief. Aan de hand van geselecteerde voorbeelden die hier worden getoond, laten we ook zien dat dit protocol schaalbaar en breed aanpasbaar is aan verschillende soorten cellen en cellijnen.

Figuur 2: De bioanalytische workflow. Microdissectie en capillaire aspiratie, of FACS, vergemakkelijkten de bemonstering van cellulair en klonaal eiwitgehalte. Uitputting van overvloedige dooiereiwitten en scheiding door capillaire elektroforese (CE) of nano-flow vloeistofchromatografie (LC) verbeterde identificatie (ID) gevoeligheid met behulp van elektrospray ionisatie (ESI) hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). Kwantificering onthulde ontregeling en leverde nieuwe informatie op voor hypothese-gedreven studies in combinatie met informatie die beschikbaar was via genontologie (GO). De cijfers zijn met toestemming aangepast aan referentie¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.