نموذج القوارض الناجم عن TNBS لدراسة الدور الممرض للإجهاد الميكانيكي في مرض كرون
Summary
يصف البروتوكول الحالي تطوير نموذج التهاب القولون الشبيه بكرون في القوارض. يؤدي الالتهاب عبر الجدارية إلى تضيق في موقع تقطير TNBS ، ويلاحظ تضخم ميكانيكي في الجزء القريب من التضيق. تسمح هذه التغييرات بدراسة الإجهاد الميكانيكي في التهاب القولون.
Abstract
أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) مثل مرض كرون (CD) هي اضطرابات التهابية مزمنة في الجهاز الهضمي تؤثر على ما يقرب من 20 لكل 1,00,000 في أوروبا والولايات المتحدة الأمريكية. يتميز CD بالالتهاب عبر الجدارية والتليف المعوي وتضيق اللمعان. على الرغم من أن العلاجات المضادة للالتهابات قد تساعد في السيطرة على الالتهاب ، إلا أنها لا تحتوي على أي فعالية على التليف والتضيق في CD. التسبب في CD ليست مفهومة جيدا. تركز الدراسات الحالية بشكل أساسي على تحديد آليات الاستجابة المناعية للأمعاء غير المنظمة. في حين أن الالتهاب عبر الجدارية المرتبط ب CD والتليف المعوي والتضيق المضيء كلها تمثل إجهادا ميكانيكيا لجدار الأمعاء ، فإن دور الإجهاد الميكانيكي في CD غير محدد جيدا. لتحديد ما إذا كان الإجهاد الميكانيكي يلعب دورا إمراضيا مستقلا في CD ، تم تطوير بروتوكول لنموذج التهاب القولون الشبيه بالقرص المضغوط الناجم عن TNBS في القوارض. يشبه هذا الالتهاب والتليف عبر الجدارية الناجم عن TNBS السمات المميزة المرضية ل CD في القولون. يتم تحريضه عن طريق التقطير داخل القولون من TNBS في القولون البعيد من الفئران Sprague-Dawley البالغة. في هذا النموذج ، يؤدي الالتهاب عبر الجدارية إلى تضيق في موقع تقطير TNBS (الموقع الأول). لوحظ انتفاخ ميكانيكي في الجزء القريب من موقع التقطير (الموقع P) ، مما يمثل الإجهاد الميكانيكي ولكن الالتهاب غير المرئي. الجزء القولوني البعيد عن الالتهاب (الموقع D) لا يمثل التهابا ولا إجهادا ميكانيكيا. لوحظت تغيرات مميزة في التعبير الجيني والاستجابة المناعية والتليف ونمو العضلات الملساء في مواقع مختلفة (P و I و D) ، مما يسلط الضوء على التأثير العميق للإجهاد الميكانيكي. لذلك ، سيساعدنا هذا النموذج من التهاب القولون الشبيه ب CD على فهم آليات CD المسببة للأمراض بشكل أفضل ، وخاصة دور الإجهاد الميكانيكي والتعبير الجيني الناجم عن الإجهاد الميكانيكي في خلل التنظيم المناعي والتليف المعوي وإعادة تشكيل الأنسجة في CD.
Introduction
يتميز مرض التهاب الأمعاء (IBD) ، بما في ذلك التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD) ، بالتهاب مزمن في الجهاز الهضمي (GI). يؤثر على ~ 1-2 مليون أمريكي1. تبلغ التكاليف السنوية المقدرة لرعاية مرض الأمعاء الالتهابي في الولايات المتحدة 11.8 مليار دولار. على عكس UC ، يتميز القرص المضغوط بالتهاب عبر الجدارية وتشكيل تضيق 2,3. يحدث تكوين التضيق (التضيق) في ما يصل إلى 70٪ من مرضى CD3 وقد يكون سببه التهاب عبر الجدارية (تضيق التهابي) أو تليف معوي (تضيق ليفي)4,5. يتميز التليف المعوي بترسب الكولاجين المفرط والمصفوفات الأخرى خارج الخلية (ECM) مع خلايا العضلات الملساء (SMC) كأحد أنواع الخلايا الوسيطة الرئيسية المشاركة في العملية 3,4. تضخم العضلات الملساء المرتبط بالتضخم هو تغيير نسيجي كبير آخر في تضيق التضيق الليفي في CD6. على الرغم من أن تكوين التضيق في CD يرتبط بالالتهاب المزمن ، إلا أنه لا يوجد علاج مضاد للالتهابات فعال ، باستثناء العلاج الجراحي 2,6. ومع ذلك ، فإن تكرار ما بعد الجراحة هو ما يقرب من 100 ٪ ، مع إعطاء الوقت الكافي 2,7. كاستجابة التهابية ، قد يتطور التليف وتضخم SMC أيضا في الحالات غير الالتهابية (أي انسداد الأمعاء) في الأمعاء 8,9 ؛ ويعتقد أن كلا من الآليات المعتمدة على الالتهاب والمستقلة تشارك في تشكيل تضيق 3,4. بالنظر إلى أن الأبحاث المكثفة في الآليات المعتمدة على الالتهاب لم تترجم إلى أي علاج فعال لتشكيل التضيق ، هناك حاجة إلى دراسات حول الدور المحتمل للآليات المستقلة عن الالتهاب في التليف المعوي.
كعامل غير التهابي ، عادة ما يصادف الإجهاد الميكانيكي (MS) المرتبط بالوذمة ، وتسلل الخلايا الالتهابية ، وتشوه الأنسجة ، والتليف ، والتضيق 10،11،12،13 في IBD ، وخاصة CD ، الذي يتميز بالالتهاب عبر الجدارية. الإجهاد الميكانيكي هو الأكثر بروزا في CD stenotic ، حيث يمثل التضيق (التهابي أو الليفي) في موقع الالتهاب إجهادا ميكانيكيا في الأنسجة المحلية ويؤدي إلى انتفاخ التجويف في الجزء القريب من موقع الانسداد10,14. وقد أظهرت الدراسات السابقة في المختبر أن الإجهاد الميكانيكي يغير التعبير الجيني لوسطاء التهابيين محددين (أي COX-2 ، IL-6) 8،14،15 وعوامل النمو (أي TGF-β) في أنسجة الجهاز الهضمي ، وخاصة خلايا العضلات الملساء المعوية (SMC) 16. وجدت الدراسات الحديثة أيضا أن التعبير عن وسطاء محددين مؤيدين للتليف مثل عامل نمو النسيج الضام (CTGF) حساس للغاية للإجهاد الميكانيكي17,18. كان من المفترض أن الإجهاد الميكانيكي قد يلعب دورا مسببا مستقلا للأمراض في الالتهاب المرتبط بالقرص المضغوط والتليف وإعادة تشكيل الأنسجة. ومع ذلك ، فإن الأهمية المسببة للأمراض للإجهاد الميكانيكي في التهاب الأمعاء والتليف وتضخم العضلات الملساء في CD لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. قد يكون هذا جزئيا لأن الالتهاب هو عملية أكثر وضوحا وأفضل دراسة من الإجهاد الميكانيكي. الأهم من ذلك ، لم يكن هناك نموذج حيواني محدد جيدا ل IBD للتمييز بين تأثير الإجهاد الميكانيكي وتأثير الالتهاب.
يصف العمل الحالي نموذجا للقوارض لالتهاب القولون الشبيه بكرون الناجم عن الحقن داخل القولون لكاشف هابتن 2,4,6-ثلاثي نيتروبنزين حمض السلفونيك (TNBS)19,20 ، والذي قد يخدم الغرض من دراسة دور الإجهاد الميكانيكي في CD. وقد وجد أن تقطير TNBS تسبب في التهاب موضعي (~ 2 سم في الطول) عبر الجدارية مع تضييق التجويف (تضيق) في القولون البعيد. يؤدي التضيق إلى انتفاخ الأمعاء الملحوظ (الإجهاد الميكانيكي) 14,15 ولكن لا يوجد التهاب مرئي في الجزء الذكري القريب من موقع التقطير. على العكس من ذلك ، فإن جزء القولون البعيد إلى موقع التضيق لا يمثل التهابا أو إجهادا ميكانيكيا. لوحظت تغيرات كبيرة خاصة بالموقع في التعبير الجيني والالتهاب والتليف وتضخم SMC في المواقع الثلاثة المختلفة. وتشير النتائج إلى أن الإجهاد الميكانيكي، وخاصة التعبير الجيني الناجم عن الإجهاد الميكانيكي، قد يلعب دورا حاسما في تطوير التليف وتضخم التنسج في التهاب القولون كرون.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم إدخال التهاب القولون الناجم عن TNBS في عام 1989 وتم استخدامه كنموذج تجريبي لمرض كرون منذ ذلك الحين19،20،23. تشمل السمات المهمة لهذا النموذج في القوارض تطور التهاب عبر الجدارية يشبه إلى حد كبير الآفات النسيجية المرضية التي تطورت في مرض كرون ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 DK124611 إلى XZS) ووزارة الدفاع الأمريكية (W81XWH-20-1-0681 إلى XZS). تم إجراء أعمال علم الأنسجة بمساعدة مختبر علم الأمراض الجراحي UTMB.
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
