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Neuroscience

Optroden-Array zur simultanen optogenetischen Modulation und elektrischen neuronalen Aufzeichnung

Published: September 01, 2022
doi:
10.3791/63460
, , , , , , ,
1Department of Electronic and Electrical Engineering,Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory,Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice,Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences,Ewha Womans University

Summary

Hier stellen wir das Herstellungsverfahren eines Optrode-Systems mit optischen Fasern für die Lichtabgabe und einem Elektrodenarray für die neuronale Aufzeichnung vor. In-vivo-Experimente mit transgenen Mäusen, die Kanalrhodopsin-2 exprimieren, zeigen die Machbarkeit des Systems für die gleichzeitige optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung.

Abstract

In den letzten zehn Jahren ist die Optogenetik aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit zur selektiven neuronalen Modulation oder Überwachung zu einem wesentlichen Werkzeug für die Untersuchung neuronaler Signale geworden. Da bestimmte Arten von neuronalen Zellen genetisch verändert werden können, um Opsin-Proteine zu exprimieren, ermöglicht die Optogenetik die optische Stimulation oder Hemmung der ausgewählten Neuronen. Es gab mehrere technologische Fortschritte im optischen System für die Optogenetik. Vor kurzem wurde vorgeschlagen, den Lichtwellenleiter für die Lichtabgabe mit elektrophysiologischer Aufzeichnung zu kombinieren, um gleichzeitig die neuronalen Reaktionen auf optogenetische Stimulation oder Hemmung zu überwachen. In dieser Studie wurde ein implantierbares Optrode-Array (2×2 optische Fasern) mit eingebetteten Mehrkanalelektroden entwickelt.

Eine Leuchtdiode (LED) wurde als Lichtquelle verwendet, und ein mikrofabriziertes Mikrolinsenarray wurde integriert, um eine ausreichende Lichtleistung an der Spitze der optischen Fasern bereitzustellen. Das optrode Array-System besteht aus dem Einwegteil und dem Mehrwegteil. Der Einwegteil verfügt über optische Fasern und Elektroden, während der wiederverwendbare Teil über die LED und die elektronische Schaltung für die Lichtsteuerung und die neuronale Signalverarbeitung verfügt. Das neuartige Design des implantierbaren Optrode-Array-Systems wird im begleitenden Video zusätzlich zum Ablauf der Optrode-Implantationschirurgie, der optogenetischen Lichtstimulation und der elektrophysiologischen neuronalen Aufzeichnung vorgestellt. Die Ergebnisse von In-vivo-Experimenten zeigten erfolgreich zeitgebundene neuronale Spikes, die durch die Lichtreize von Hippocampus-erregenden Neuronen von Mäusen hervorgerufen wurden.

Introduction

Die Aufzeichnung und Kontrolle der neuronalen Aktivität ist unerlässlich, um zu verstehen, wie das Gehirn in einem neuronalen Netzwerk und auf zellulärer Ebene funktioniert. Herkömmliche elektrophysiologische Aufzeichnungsmethoden umfassen die Patch-Klemme 1,2,3,4 mit einer Mikropipette und die extrazelluläre Aufzeichnung mit mikroneuralen Elektroden 5,6,7,8. Als Neuromodulationsmethode wurde die elektrische Stimulation häufig verwendet, um eine fokale Hirnregion durch direkte oder indirekte Depolarisation neuronaler Zellen direkt zu stimulieren. Das elektrische Verfahren kann jedoch keine neuronalen Zelltypen zur Aufzeichnung oder Stimulation unterscheiden, da sich die elektrischen Ströme in alle Richtungen ausbreiten.

Als aufstrebende Technologie hat die Optogenetik eine neue Ära eingeleitet, um zu verstehen, wie das Nervensystem funktioniert 9,10,11,12,13,14,15,16. Das Wesen der optogenetischen Techniken besteht darin, Licht zu verwenden, um die Aktivität von lichtempfindlichen Opsinproteinen zu kontrollieren, die von genetisch veränderten Zellen exprimiert werden. So ermöglicht die Optogenetik die ausgeklügelte Modulation oder Überwachung genetisch selektierter Zellen in komplizierten neuronalen Schaltkreisen14,17. Die breitere Anwendung des optogenetischen Ansatzes erforderte eine gleichzeitige neuronale Aufzeichnung, um die optische Neuromodulation direkt zu bestätigen. Daher wäre ein integriertes Gerät mit Lichtsteuerungs- und Aufzeichnungsfunktionen äußerst wertvoll 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Es gibt Einschränkungen der herkömmlichen, laserbasierten optogenetischen Stimulation, die ein sperriges und teures Lichtabgabesystem26,27,28,29,30 erfordert. Daher verwendeten einige Forschungsgruppen μLED-basierte Siliziumsonden, um die Größe des Lichtabgabesystems31,32,33,34 zu minimieren. Es besteht jedoch die Gefahr von thermischen Hirnschäden, die durch direkten Kontakt mit μLEDs aufgrund der geringen Energieumwandlungseffizienz von LEDs verursacht werden. Lichtwellenleiter wie optische Fasern, SU-8 und Siliziumoxynitrid (SiON) wurden angewendet, um thermische Schäden zu vermeiden 30,35,36,37,38,39. Diese Strategie hat jedoch auch einen Nachteil aufgrund ihrer geringen Kopplungseffizienz zwischen Lichtquellen und den Wellenleitern.

Das Mikrolinsen-Array wurde zuvor eingeführt, um die Lichtkopplungseffizienz zwischen LEDs und optischen Fasernzu verbessern 40. Es wurde ein optrode-System entwickelt, das auf mikroelektromechanischen Systemen (MEMS) Technologien zur optischen Stimulation und elektrischen Aufzeichnung im Mikromaßstab40 basiert. Das Mikrolinsenarray zwischen einer LED und optischen Fasern erhöhte die Lichtausbeute um 3,13 dB. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wird ein 2×2-Glasfaser-Array auf dem 4×4-Mikrolinsen-Array ausgerichtet, und die LED wird unter dem Mikrolinsen-Array positioniert. Die 2×2 optischen Fasern werden anstelle von 4×4 montiert, um Hirnschäden zu reduzieren. Ein Wolfram-Elektroden-Array wird neben dem Optrode-Array positioniert, wobei Silizium über Löcher für die elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet wird (Abbildung 1B).

Das System besteht aus einem oberen Einwegteil und abnehmbaren unteren Teilen. Der Top-Einwegteil, der das optische Faserarray, das Mikrolinsen-Array und das Wolfram-Elektroden-Array umfasst, ist so konzipiert, dass es für In-vivo-Experimente dauerhaft in das Gehirn implantiert werden kann. Der untere Teil enthält eine LED-Lichtquelle und eine externe Stromversorgungsleitung, die leicht abnehmbar und für einen anderen Tierversuch wiederverwendbar ist. Eine aufsteckbare Kunststoffabdeckung schützt das Einwegteil, wenn das abnehmbare Teil entfernt wird.

Die Machbarkeit des Systems wird durch Implantation in das Gehirn transgener Mäuse bestätigt, die Channelrhodopsin-2 (ChR2) in Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II-positiven Neuronen exprimieren (CaMKIIα::ChR2-Maus). Aufzeichnungselektroden wurden verwendet, um die neuronalen Aktivitäten einzelner Neuronen während der optischen Stimulation der Neuronen aufzuzeichnen.

Protocol

Die Tierpflege und chirurgischen Eingriffe wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Ewha Womans University (Nr. 20-029) genehmigt. 1. Vorbereitung eines optrode Arrays (Abbildung 1 und Abbildung 2) Befestigen Sie optische Fasern mit dem Mikrolinsenarray. Entfernen Sie die Passivierungsbeschichtung der optischen Faser und schneiden Sie sie…

Representative Results

Das optrode-System wurde erfolgreich hergestellt, um eine ausreichende Lichtleistung zur Aktivierung der Zielneuronen bereitzustellen. Die feine Ausrichtung der Wolframelektroden wird durch das mikrofabrizierte Silizium über die Löcher erreicht. Die gemessene Lichtintensität beträgt 3,6 mW/mm2 an der Lichtwellenleiterspitze, wenn 50 mA Strom angelegt wird. Die Mikrolinse erhöhte die Lichtausbeute um 3,13 dB. Aufgrund des Mikrolinsenarrays, das die Lichtkopplung verbessert, beträgt der angelegte Strom etw…

Discussion

Die Machbarkeit des Systems zur gleichzeitigen optogenetischen Stimulation und elektrophysiologischen Aufzeichnung wurde nachgewiesen (Abbildung 6). Die großen Spikes während der Lichtstimulation sind photoelektrische Artefakte, die gleichzeitig mit der Lichtstimulation auftreten (Abbildung 6A). Dies wird in der gezoomten Ansicht der Wellenform im rot gestrichelten Rechteck deutlich (Abbildung 6A). Wie in Abbi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde durch das Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (NRF-2019M3C1B8090805) finanziert und durch einen von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierten Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) (Nr. 2019R1A2C1088909) unterstützt wurde. Wir danken Seung-Hee Lees Labor am Department of Biological Sciences, KAIST, Daejeon, Korea, für die freundliche Bereitstellung der transgenen Mäuse.

Materials

5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus
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Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C., Kim, Y., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).
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