Medição da taxa de consumo de oxigênio em fatias estriatais agudas de camundongos adultos

A disfunção mitocondrial tem sido implicada em várias doenças neurológicas, incluindo a doença de Parkinson (DP), doença de Huntington e doença de Alzheimer ^1,2,3. Modelos PD como camundongos e ratos pink1 knockout (KO) exibem função mitocondrial prejudicada^função 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitocôndrias isoladas do estrias (STR) ou cérebro inteiro do camundongo PINK1 KO envelhecem exibem defeitos no complexo I 7,10,12,13. Medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um dos métodos mais comuns para avaliar a função mitocondrial, uma vez que o OCR está associado à produção de ATP, a principal função das mitocôndrias¹⁴. Portanto, medir o OCR em modelos de doenças ou amostras/tecidos derivados do paciente pode ajudar a investigar como a disfunção mitocondrial leva à doença.

Atualmente, existem várias maneiras de medir o OCR mitocondrial, incluindo o eletrodo Clark e outros eletrodos O₂, corante fluorescente O₂, e o analisador de fluxo extracelular 15,16,17,18,19. Como vantagem, os métodos baseados em eletrodos O₂ permitem que vários substratos sejam facilmente adicionados. No entanto, são insuficientes para medir simultaneamente várias amostras. Comparado aos métodos tradicionais baseados em eletrodos O₂, o analisador de fluxo extracelular, uma ferramenta comumente usada para OCR em culturas celulares ou mitocôndrias purificadas, oferece melhor throughput 15,18,20. No entanto, todos esses métodos são geralmente aplicados para medir o OCR em mitocôndrias isoladas ou culturas celulares 6,16,17,19,20,21. O isolamento das mitocôndrias causa danos inadvertidos, e mitocôndrias extraídas ou culturas celulares são menos relevantes fisiologicamente do que as fatias cerebrais intactas²². Mesmo quando microeletrodos são usados em fatias, eles são menos sensíveis e mais difíceis de operar do que em células cultivadas²³.

Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um método utilizando o analisador de fluxo extracelular XF24, que permite a análise de múltiplos parâmetros metabólicos a partir de fatias cerebrais estriais agudas de camundongos²⁴. Esta técnica fornece quantificação contínua direta da respiração mitocondrial através do OCR. Em suma, pequenas seções de fatias cerebrais striatais são colocadas em poços da placa de ilhota, e o analisador usa biosensores à base de oxigênio e prótons fluorescentes para medir a taxa de acidificação OCR e extracelular, respectivamente 17,21,25.

Uma das características únicas do analisador são os quatro poços de injeção, que permitem a medição contínua do OCR enquanto injetam sequencialmente até quatro compostos ou reagentes; isso permite a medição de vários parâmetros de respiração celular, como OCR mitocondrial basal, OCR ligado a ATP e OCR mitocondrial máximo. Os compostos injetados durante as medições para o protocolo aqui mostrado foram concentrações de trabalho de piruvato de 10 mM na primeira solução bem (porta A), 20 μM de oligomicina na segunda solução bem (porta B), 10 μM cianeto de carbonil 4-(trifluorometoxy) fenilhidrazone (FCCP) no terceiro poço (porta C), e 20 μM antimicina A no quarto poço (porta D), com base em Fried et ^al.25. Deve-se notar que essas concentrações foram concentrações de trabalho, e soluções de estoque de 10x, 11x, 12x e 13x foram injetadas nas portas de solução A a D, respectivamente. O objetivo de utilizar cada solução foi o seguinte: 1) O piruvato foi necessário, pois, sem ela, a adição de FCCP teria uma resposta OCR reduzida causada por uma limitação dos substratos disponíveis; 2) A oligomicina inibe a synthase ATP e permite a medição da respiração ligada ao ATP; 3) A FCCP desacoplula a oxidação da fosforilação e permite a medição da capacidade mitocondrial máxima; 4) A antimicina inibe o complexo III na cadeia de transporte de elétrons e, portanto, permite a medição do OCR não ligado às mitocôndrias.

A concentração de oligomicina utilizada foi determinada com base nas seguintes razões: 1) A dose recomendada de oligomicina para a maioria dos tipos de células (mitocôndrias isoladas ou culturas celulares) é de 1,5 μM. Pela experiência, geralmente 3x-10x da dose de células dissociadas é usado para os experimentos de fatia, uma vez que pode haver um gradiente, e a penetração da solução nas fatias leva tempo. Portanto, a concentração deve estar na faixa de 5 μM a 25 μM. 2) Foi selecionada uma concentração de 20 μM com base em Fried et ^al.25. Maiores concentrações não foram tentadas devido à toxicidade não específica da oligomicina. 3) No relatório de Underwood et ^al.26, os autores fizeram um experimento de titulação para oligomicina e descobriram que as doses em 6,25, 12,5, 25 e 50 μg/mL resultaram em inibição semelhante. A maior concentração de oligomicina (50 μg/mL) não inibiu mais, mas apresentou maior variância. 4) Em nossa observação, o fator determinante parece ser a capacidade penetrante da oligomicina. É difícil para a oligomicina penetrar no tecido, e é por isso que leva pelo menos 7 a 8 ciclos para chegar ao planalto, a resposta máxima. Desde que atinja o planalto, a inibição é assumida como máxima.

Um dos principais desafios técnicos da adaptação do analisador de fluxo extracelular para medir OCR em fatias estriais é prevenir a hipóxia tecidual. Como o tampão não foi oxigenado durante toda a duração das medições (cerca de 4h), a hipóxia foi um problema central. Isso é especialmente verdadeiro para amostras de tecido mais espessas, onde o oxigênio não pode se difundir em todas as amostras. Para superar esse problema, as fatias foram seccionadas com 150 μm de espessura, para que o oxigênio ambiente pudesse penetrar no meio das fatias cerebrais. Além disso, 4 mg/mL de soro bovino albumina (BSA) foi adicionado ao buffer de fluido cerebrospinal artificial pré-oxigenado (ACSF), o que facilitou a determinação do OCR máximo, como sugerido anteriormente²³. Examinamos se as células estavam vivas. Primeiro, hoechst 33258 (10 μM) e iodeto de propidium (10 μM) foram usados para examinar se as células eram saudáveis nessas condições. Em seguida, examinamos se os neurônios espinhosos médios eram funcionalmente saudáveis usando a gravação de grampo de remendo. Avaliamos ainda se os terminais de dopamina (DA) nas fatias estriais eram funcionalmente saudáveis, medindo a liberação de DA usando voltammemetria de varredura rápida. Os resultados mostraram que as fatias estriais que não estavam oxigenadas (grupo ACSF/BSA) eram tão saudáveis quanto o grupo de controle oxigenado²⁴.

Em seguida, testamos diferentes combinações de espessura de fatia e tamanho do soco para determinar as condições ideais de fatia striatal para o ensaio de respiração de fluxo. Foram utilizadas fatias estriais dorsais com espessuras diferentes (150 μm e 200 μm) e tamanhos de perfuração (1,0 mm, 1,5 mm e 2,0 mm de diâmetro) para análise de OCR utilizando o analisador. As fatias striatais de 150 μm de espessura com um tamanho de soco de 1,5 mm de diâmetro tiveram a maior eficiência de acoplamento e OCRs dentro de uma faixa ideal para o analisador²⁴.