测量成年小鼠急性纹状体切片中的耗氧率
Summary
耗氧率（OCR）是线粒体功能的常见代理，可用于研究不同的疾病模型。我们开发了一种使用Seahorse XF分析仪的新方法，直接测量成年小鼠急性纹状体切片中的OCR，该方法比其他方法更具生理相关性。
Abstract
线粒体在细胞ATP产生，活性氧调节和Ca2 + 浓度控制中起重要作用。线粒体功能障碍与多种神经退行性疾病的发病机制有关，包括帕金森病（PD），亨廷顿病和阿尔茨海默病。为了研究线粒体在这些疾病的模型中的作用，我们可以通过耗氧率（OCR）作为线粒体功能的代表来测量线粒体呼吸。OCR已经在细胞培养物以及分离的线粒体中成功测量。然而，与在急性脑切片中测量OCR相比，这些技术在生理上的相关性较低。为了克服这一限制，作者开发了一种使用Seahorse XF分析仪的新方法，直接测量成年小鼠急性纹状体切片中的OCR。该技术经过优化，重点是纹状体，纹状体是参与PD和亨廷顿舞蹈症的大脑区域。该分析仪使用24孔板进行活细胞测定，允许同时测量24个样品的动力学。该方法使用圆形打孔的纹状体脑切片作为样品。我们通过鉴定PD小鼠模型纹状体切片中较低的基础OCR来证明该技术的有效性。这种方法将引起从事PD和亨廷顿舞蹈症研究领域的研究人员的广泛兴趣。
Introduction
线粒体功能障碍与几种神经系统疾病有关，包括帕金森病（PD），亨廷顿病和阿尔茨海默病1，2，3。PD模型如PINK1敲除（KO）小鼠和大鼠显示线粒体功能受损4，5，6，7，8，9，10，11。从纹状体（STR）或老年PINK1 KO小鼠的全脑分离的线粒体在复合物I7，10，12，13中表现出缺陷。直接测量耗氧率（OCR）是评估线粒体功能的最常用方法之一，因为OCR与ATP产生相结合，ATP是线粒体14的主要功能。因此，在疾病模型或患者来源的样本/组织中测量OCR可以帮助研究线粒体功能障碍如何导致疾病。
目前，测量线粒体OCR的方法有几种，包括Clark电极和其他O2电极，O2荧光染料，以及细胞外通量分析仪15，16，17，18，19。作为一个优点，基于O2电极的方法允许轻松添加各种基板。然而，它们不足以同时测量多个样品。与传统的基于O2电极的方法相比，细胞外通量分析仪是细胞培养物或纯化线粒体中常用的OCR工具，可提高通量15，18，20。然而，所有这些方法通常用于测量分离的线粒体或细胞培养物6，16，17，19，20，21中的OCR。线粒体的分离导致无意的损害，并且提取的线粒体或细胞培养物在生理上的相关性低于完整的脑切片22。即使将微电极用于切片中，它们也比培养细胞23更不敏感且更难以操作。
为了应对这些挑战，我们开发了一种使用XF24细胞外通量分析仪的方法，该方法允许分析来自小鼠24急性纹状体脑切片的多种代谢参数。该技术通过OCR提供线粒体呼吸的连续直接定量。简而言之，将小部分纹状体脑切片放入胰岛板的孔中，分析仪使用基于氧和质子荧光的生物传感器测量OCR和细胞外酸化速率，分别为17，21，25。
分析仪的独特功能之一是四个进样孔，允许继续测量OCR，同时按顺序进样多达四种化合物或试剂。这样可以测量几个细胞呼吸参数，例如基础线粒体OCR，ATP连接OCR和最大线粒体OCR。在测量此处显示的方案期间注入的化合物是第一个溶液孔（端口A）中10 mM丙酮酸盐的工作浓度，第二个溶液孔（端口B）中20μM寡霉素的工作浓度，第三孔（端口C）中的10μM羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）和第四孔（端口D）中20μM抗霉素A， 基于弗里德等人25。必须注意的是，这些浓度是工作浓度，分别将10x，11x，12x和13x的储备溶液注入溶液端口A至D。使用每种溶液的目的是：1）丙酮酸盐是必要的，因为没有它，FCCP的添加将因可用底物的限制而降低OCR响应;2）寡霉素抑制ATP合酶并允许测量ATP连锁呼吸;3）FCCP将氧化与磷酸化解耦，并允许测量最大线粒体容量;4）抗霉素A抑制电子传递链中的复合物III，因此允许测量与线粒体无关的OCR。
根据以下原因确定使用的寡霉素浓度：1）大多数细胞类型（分离的线粒体或细胞培养物）的寡霉素推荐剂量为1.5μM。根据经验，通常将解离细胞剂量的3x-10x用于切片实验，因为可能存在梯度，并且切片中溶液的渗透需要时间。因此，浓度应在5μM至25μM的范围内。由于寡霉素的非特异性毒性，没有尝试更高的浓度。3）在Underwood等人的报告中，作者对寡霉素进行了滴定实验，发现6.25，12.5，25和50μg/ mL的剂量导致类似的抑制。较高浓度的寡霉素（50μg/mL）不会抑制更多，但具有更大的差异。4）在我们的观察中，决定因素似乎是寡霉素的穿透能力。寡霉素很难穿透组织，这就是为什么至少需要7到8个周期才能达到平台，最大的反应。只要它到达高原，就假定抑制是最大的。
调整细胞外通量分析仪以测量纹状体切片中的OCR的一个关键技术挑战是防止组织缺氧。由于缓冲液在整个测量期间（约4小时）没有含氧，缺氧是一个核心问题。对于较厚的组织样品尤其如此，其中氧气不能扩散到整个样品中。为了克服这个问题，切片以150μm的厚度切片，以便环境氧气可以穿透大脑切片的中间。此外，将4 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）加入到预含氧人工脑脊液（ACSF）缓冲液中，这有助于测定最大OCR，如前所述23。我们检查了细胞是否存活。首先，使用Hoechst 33258（10μM）和碘化丙啶（10μM）来检查细胞在这些条件下是否健康。然后，我们使用膜片钳记录检查中等多棘神经元的功能是否健康。我们通过使用快速扫描伏安法测量DA释放，进一步评估纹状体切片中的多巴胺（DA）末端是否功能健康。结果显示，未含氧的纹状体切片（ACSF/BSA组）与含氧对照组24一样健康。
然后，我们测试了切片厚度和冲头尺寸的不同组合，以确定通量呼吸测定的最佳纹状体切片条件。使用分析仪对不同厚度（150 μm和200 μm）和冲头尺寸（直径为1.0 mm、1.5 mm和2.0 mm）的背纹状体切片进行OCR分析。直径为1.5 mm的纹状体切片厚150 μm，具有最高的耦合效率，OCR在分析仪24的最佳范围内。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们开发的方法允许使用XF分析仪在4小时的时间跨度内测量成年小鼠纹状体切片中的OCR。这种方法提供了一种测量从解剖学定义的大脑结构中切除的冲头中的细胞生物能量学的新方法。由于正在分析的组织样本相当小，因此可以研究与疾病有关的特定脑区域的代谢参数。此外，使用急性切片更接近于模拟生理细胞环境，这是分离的线粒体或培养的细胞和有机类型切片无法实现的。此外，在单个动?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢旺钦次仁和帕梅拉·沃尔特对这份手稿的批判性阅读和编辑。这项工作得到了国家神经疾病和中风研究所（NINDS）（NS054773至C.J.L.和NS098393至H.Z.）和托马斯杰斐逊大学神经科学系（H.Z.的启动基金）的支持。
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
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