Modelagem da Hemorragia Intraventricular Neonatal Através da Injeção Intraventricular de Hemoglobina
Summary
Apresentamos um modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando filhotes de ratos que mimetiza a patologia observada em humanos.
Abstract
A hemorragia intraventricular neonatal (IVH) é uma consequência comum do parto prematuro e leva a lesão cerebral, hidrocefalia pós-hemorrágica (HPH) e déficits neurológicos ao longo da vida. Embora a PHH possa ser tratada por procedimentos de desvio temporários e permanentes do líquido cefalorraquidiano (LCR) (reservatório ventricular e shunt ventriculoperitoneal, respectivamente), não há estratégias farmacológicas para prevenir ou tratar lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia. Modelos animais são necessários para entender melhor a fisiopatologia da IVH e testar tratamentos farmacológicos. Embora existam modelos existentes de HVI neonatal, aqueles que resultam de forma confiável em hidrocefalia são frequentemente limitados pela necessidade de injeções de grande volume, o que pode complicar a modelagem da patologia ou introduzir variabilidade no fenótipo clínico observado.
Estudos clínicos recentes implicaram hemoglobina e ferritina na causa de aumento ventricular após IVH. Aqui, desenvolvemos um modelo animal simples que imita o fenótipo clínico da PHH utilizando injeções intraventriculares de pequeno volume do produto de degradação do sangue hemoglobina. Além de induzir de forma confiável o aumento ventricular e a hidrocefalia, esse modelo resulta em lesão da substância branca, inflamação e infiltração de células imunes nas regiões periventricular e da substância branca. Este trabalho descreve este método clinicamente relevante e simples para modelar a HPH-IV em ratos neonatais usando injeção intraventricular e apresenta métodos para quantificar o tamanho do ventrículo após a injeção.
Introduction
A IVH neonatal origina-se da matriz germinativa, um local de rápida divisão celular adjacente aos ventrículos laterais do cérebro em desenvolvimento. Essa estrutura altamente vascular é vulnerável à instabilidade hemodinâmica relacionada ao parto prematuro. O sangue é liberado nos ventrículos laterais na hemorragia da matriz germinativa (GMH)-IVH quando os vasos sanguíneos frágeis dentro da matriz germinativa se rompem. No caso da IV IV de grau IV, o infarto hemorrágico periventricular também pode contribuir para a liberação de hemoderivados dentro do cérebro. 1 A combinação de GMH-IVH pode causar HPH, particularmente após hemorragia de alto grau (graus III e IV)1. A HPH pode ser tratada com a colocação de um shunt ventriculoperitoneal, mas a colocação do shunt não reverte a lesão cerebral que pode ocorrer a partir da IVH. Embora a terapia intensiva neonatal moderna tenha reduzido as taxas de IVH2, 3, não há tratamentos específicos para a lesão cerebral ou hidrocefalia causada pela IVH uma vez que tenha ocorrido. Uma limitação significativa no desenvolvimento de tratamentos preventivos para lesão cerebral induzida por HIV e HPH é a compreensão incompleta da fisiopatologia da HIV.
Recentemente, os níveis iniciais do LCR de hemoglobina de produto chave de degradação do sangue demonstraram estar associados ao desenvolvimento posterior de PHH em neonatos com IVH de alto grau4. Além disso, os níveis de proteínas da via de manipulação de ferro no LCR – hemoglobina, ferritina e bilirrubina – estão associados ao tamanho do ventrículo na IVH neonatal. Isso também foi demonstrado em uma coorte multicêntrica de lactentes com HPH pré-termo, onde níveis mais elevados de ferritina no LCR ventricular foram associados a um tamanho maior do ventrículo5.
Neste estudo, desenvolvemos um modelo clinicamente relevante de lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia utilizando injeção de hemoglobina nos ventrículos cerebrais, que permite quantificar a lesão cerebral e a HPH e testar novas estratégias terapêuticas (Figura 1)6, 7. Este modelo IVH utiliza filhotes de ratos neonatais, que são colocados sob anestesia geral durante o procedimento. Uma incisão na linha média é feita no couro cabeludo, e coordenadas derivadas de marcos do crânio – o bregma ou lambda – são usadas para atingir os ventrículos laterais para injeção. A injeção lenta usando uma bomba de infusão fornece hemoglobina no ventrículo. Este protocolo é fácil de usar, versátil e pode modelar diferentes componentes da IVH que resultam em PHH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este modelo de IVH utilizando injeção de hemoglobina permite o estudo da patologia da IVH especificamente mediada pela hemoglobina. Para estudos complementares, a hemoglobina também pode ser facilmente administrada in vitro e não confunde ensaios bioquímicos para proteínas produzidas por micróglias / macrófagos que estão presentes no sangue total.
As principais teorias da HIF-IV incluem a obstrução mecânica da circulação do LCR, a ruptura dos cílios que revestem as pare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O JMS recebeu financiamento do NIH/NINDS R01 NS110793 e K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). A BAM recebeu financiamento do NIH/NINDS K08 NS112580-01A1, Prêmio da Área Prioritária de Pesquisa em Neurociência da Universidade de Kentucky e um Prêmio Inovador da Associação de Hidrocefalia .
Materials
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
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