Summary

Ex Vivo Перфузия печени через воротную вену у мыши

Published: March 09, 2022
doi:

Summary

Протокол описывает простой метод резекции интактной печени мыши для метаболических исследований посредством перфузии воротных вен.

Abstract

Метаболические заболевания, такие как диабет, преддиабет, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) и неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), становятся все более распространенными. Перфузии печени ex vivo позволяют проводить комплексный анализ метаболизма печени с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в условиях питания, которые можно строго контролировать. Поскольку в silico моделирование остается в первую очередь теоретическим средством оценки гормональных действий и эффектов фармацевтического вмешательства, перфузированная печень остается одним из самых ценных испытательных стендов для понимания печеночного метаболизма. Поскольку эти исследования направляют базовое понимание физиологии печени, результаты должны быть точными и воспроизводимыми. Наибольшим фактором воспроизводимости печеночной перфузии ex vivo является качество хирургического вмешательства. Поэтому мы ввели организованный и оптимизированный метод выполнения перфузий печени мышей ex vivo в контексте экспериментов с ЯМР in situ . Мы также описываем уникальное приложение и обсуждаем общие проблемы, возникающие в этих исследованиях. Общая цель состоит в том, чтобы предоставить несложное руководство по технике, которую мы усовершенствовали в течение нескольких лет, которую мы считаем золотым стандартом для получения воспроизводимых результатов в печеночных резекциях и перфузиях в контексте экспериментов in situ ЯМР. Расстояние до центра поля для магнита, а также недоступность ткани для вмешательства во время эксперимента ЯМР делает наши методы новыми.

Introduction

Перфузии ex vivo имеют решающее значение в изучении печеночного метаболизма, и перфузия через воротную вену является стандартом для этих исследований. Чтобы изучать печеночный обмен в изоляции, печень должна быть резецирована из организма, чтобы избежать осложнений, возникающих в результате метаболизма в других органах (т. Е. Метаболизм всего тела) и осуществлять контроль над доступностью гормонов (инсулин, глюкагон и т. Д.). Этот подход может иметь важное значение для понимания влияния таких заболеваний, как диабет, НАЖБП и НАСГ, на печеночный метаболизм, а также механизмов действия лекарств. Эта статья служит руководством по печеночной резекции и перфузии. Мы разработали упрощенную процедуру для выполнения этих метаболических исследований печени с достаточной строгостью и воспроизводимостью. Если операция выполнена неправильно, наблюдается выраженная вариабельность полученных метаболических данных. Описан организованный метод выполнения портальной катетеризации вен и резекции печени в контексте метаболических исследований in situ в спектрометре ядерного магнитного резонанса (ЯМР), описанный в литературе 1,2,3,4,5.

В настоящее время нет литературы, описывающей перфузию печени ex vivo с использованием стеклянной колонки в ЯМР. Также нет видео или текстовой публикации, предоставляющей четкий пример того, как выполнять процедуру с печенью мыши, в частности, демонстрирующей, как катетеризировать воротную вену, резецировать печень, переносить и вешать печень на стеклянную колонку. Поскольку генетически модифицированная мышь повсеместно используется для изучения метаболизма печени, это важная процедура, которая заслуживает полного описания. Операции по перфузии печени не новы, но эта статья является методом золотого стандарта, сопровождаемым видео, демонстрирующим техническое совершенство, описанное в этой статье, чтобы помочь всем, кто заинтересован в этой процедуре. Метод, представленный здесь, лучше всего применять к метаболизму в режиме реального времени для обнаружения функции и оборота метаболитов в моделях заболеваний.

Этот метод использует стеклянную колонку с водяной рубашкой длиной 100 см, которая позволяет печени висеть на дне канюли, инкапсулированной перфусатом внутри ЯМР-трубки. Нагретая вода в стеклянной рубашке используется для контроля температуры перфусата. Тонкослойный оксигенатор находится под давлением с 95%/5% O2/CO2 для контроля pH. С помощью трех отдельных насосов устанавливается высота колонны перфусата, которая обеспечивает постоянное давление на печень. Расход не контролируется сверх приложения постоянного давления (рисунок 1). Чтобы подтвердить, что печень функционирует надлежащим образом, измерения кислорода проводятся вместе со скоростью потока. В наших руках этот набор предварительных условий приводит к высоковоспроизводимым экспериментам ЯМР для оценки метаболической функции печени.

Protocol

Эксперименты с участием мышей проводились в соответствии с Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Флориды (протокол No 201909320). Используемый штамм мыши был C57BL/6J; все мыши были самцами. Этот метод обычно применим и для исследований с использованием др…

Representative Results

Функция печени в первую очередь оценивается по потреблению кислорода и скорости потока. Типичны скорость потока 4-8 мл/мин и потребление кислорода 1 мкмоль/мин.г. Эти меры будут варьироваться в зависимости от конкретных экспериментальных условий и биологических различий. <p class="jove_content"…

Discussion

Эта хирургическая процедура является сложной и требует обширной практики для достижения воспроизводимых результатов. Изофлуран и газ-носитель должны быть отрегулированы по мере необходимости, чтобы поддерживать жизнеспособность животного на протяжении большей части хирургической …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана финансированием Национальных институтов здравоохранения (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Часть этой работы была выполнена в Институте мозга Макнайта в Центре передовой магнитно-резонансной томографии и спектроскопии (AMRIS) Национальной лаборатории магнитного поля, который поддерживается Соглашением о сотрудничестве Национального научного фонда No. DMR-1644779 и штат Флорида.

Materials

1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe N/A N/A Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column N/A N/A Custom Made
2-0 Silk Suture Braintree Scientific N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety Terumo SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles Exel International 26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles Exel International 26426
4×4 in. Surgical Platform N/A N/A Custom Made
70% Alcohol Wipe N/A N/A Non-specific Brand
Circulating Water Bath MS Lauda N/A Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator N/A N/A Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " Roboz RS-6702
Dumont #5/45 Forceps Fine Scientific Tools 11251-35
Dumont #7 – Fine Forceps Fine Scientific Tools 11274-20
Hemostats Fine Scientific Tools 13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL RX Generics 71288-0402-02
Isoflurane Patterson Veterinary 14043-0704-06
Lidocaine HCl 2% VEDCO Inc. 50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator Radnoti N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " Roboz RS-6013
Oxygen Meter System Hanstech Instruments Ltd. N/A
Saline 0.9% Solution N/A N/A Saline is made in lab
Scale N/A N/A Non-specific Brand
 Variable Speed Analog Console Pump Systems Cole Palmer N/A Models are custom per application
Weigh boats N/A N/A Non-specific Brand

References

  1. Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
  2. Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
  3. Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
  4. Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
  5. Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
  6. Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
  7. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
  8. Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
  9. Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
  10. Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
  11. Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
  12. . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
  13. Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
  14. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  15. . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
  16. . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
  17. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).

Play Video

Cite This Article
Giacalone, A. G., Merritt, M. E., Ragavan, M. Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse. J. Vis. Exp. (181), e63154, doi:10.3791/63154 (2022).

View Video