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Ex Vivo 마우스의 포털 정맥을 통한 간 관류

Published: March 09, 2022
doi:

Summary

이 프로토콜은 포털 정맥 관류를 통한 대사 연구를 위해 손상되지 않은 마우스 간을 절제하는 간단한 방법을 설명합니다.

Abstract

당뇨병, 전당뇨병, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알콜성 지방간염(NASH)과 같은 대사성 질환이 점점 더 흔해지고 있습니다. 생체외 간 관류는 엄격하게 조절될 수 있는 영양 조건에서 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 간 대사를 종합적으로 분석할 수 있게 해줍니다. 실리코 시뮬레이션에서와 마찬가지로 호르몬 작용과 제약 개입의 효과를 평가하는 주로 이론적 인 수단으로 남아 있기 때문에 관류 된 간은 간 대사를 이해하기위한 가장 가치있는 테스트 베드 중 하나입니다. 이 연구들이 간 생리학에 대한 기본적인 통찰력을 안내하기 때문에 결과는 정확하고 재현 가능해야합니다. 생체외 간 관류의 재현성의 가장 큰 요인은 수술의 질이다. 따라서, 우리는 현장 NMR 실험의 맥락에서 생체외 마우스 간 관류를 수행하기 위해 조직적이고 간소화 방법을 도입했습니다. 우리는 또한 독특한 응용 프로그램을 설명하고 이러한 연구에서 직면 한 일반적인 문제에 대해 논의합니다. 전반적인 목적은 현장 NMR 실험의 맥락에서 간 절제술 및 관류에서 재현 가능한 결과를 얻기위한 황금 표준으로 간주되는 몇 년 동안 정제 한 기술에 대한 복잡하지 않은 가이드를 제공하는 것입니다. 자석에 대한 필드 중심까지의 거리뿐만 아니라 NMR 실험 중에 개입 할 수있는 조직의 접근성이 없기 때문에 우리의 방법은 새로운 방법입니다.

Introduction

생체 외 관류는 간 대사 연구에서 매우 중요하며, 포털 정맥을 통한 관류는 이러한 연구의 표준입니다. 간 대사를 개별적으로 연구하기 위해서는 다른 장기의 신진 대사 (즉, 전신 대사)로 인한 합병증을 피하고 호르몬 가용성 (인슐린, 글루카곤 등)을 조절하기 위해 간을 신체에서 절제해야합니다. 이 접근법은 당뇨병, NAFLD 및 NASH와 같은 질병이 간 대사에 미치는 영향뿐만 아니라 약물 작용 메커니즘을 이해하는 데 필수적 일 수 있습니다. 이 기사는 간 절제술과 관류에 대한 가이드 역할을합니다. 우리는 충분한 엄격함과 재현성으로 이러한 대사 간 연구를 수행하기위한 간소화 된 절차를 개발했습니다. 수술이 올바르게 수행되지 않으면 얻은 대사 데이터에 뚜렷한 변동성이 있습니다. 우리는 문헌 1,2,3,4,5에 기재된 바와 같이, 핵 자기 공명 (NMR) 분광계에서 계내에서 대사 연구의 맥락에서 문맥 정맥 카테터 삽입 및 간 절제술을 수행하는 조직화 된 방법을 기술한다.

현재, NMR 내의 유리 컬럼을 이용한 생체외 간 관류를 기술하는 문헌은 없다. 또한 마우스 간으로 절차를 수행하는 방법에 대한 명확한 예를 제공하는 비디오 또는 텍스트 간행물도 없으며, 특히 포털 정맥을 카테터화하고, 간을 절제하고, 간을 유리 기둥에 걸고, 매달아 놓는 방법을 보여줍니다. 유전자 변형 마우스는 간 대사를 연구하는 데 유비쿼터스로 사용되기 때문에 이것은 완전한 설명을받을 가치가있는 필수 절차입니다. 간 관류 수술은 새로운 것이 아니지만이 기사는이 절차에 관심이있는 모든 사람들을 돕기 위해이 논문에 설명 된 기술적 우수성을 보여주는 비디오와 함께 황금 표준 방법입니다. 여기에 제시된 방법은 질병 모델에서 대사 산물의 기능과 회전율을 감지하기 위해 실시간 신진 대사에 가장 잘 적용될 것입니다.

이 방법은 100cm 물 재킷 유리 컬럼을 사용하여 간이 NMR 튜브 내부의 향수에 의해 캡슐화 된 캐뉼라의 바닥에 매달릴 수있게합니다. 유리 재킷의 가열 된 물은 향수 온도를 제어하는 데 사용됩니다. 박층 산소 발생기는 pH 제어를 위해 95 % / 5 % O2 /CO2로 가압됩니다. 세 개의 개별 펌프를 사용하여 향수 컬럼 높이를 설정하여 간에 일정한 압력을 제공합니다. 유량은 일정한 압력의 적용 이상으로 제어되지 않습니다(그림 1). 간이 적절하게 기능하고 있는지 확인하기 위해 산소 측정은 유속과 함께 수행됩니다. 우리의 손에,이 전제 조건의 세트는 간 대사 기능의 평가를위한 매우 반복 가능한 NMR 실험으로 이어집니다.

Protocol

마우스와 관련된 실험은 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 #201909320)에 따라 처리되었습니다. 사용된 마우스 균주는 C57BL/6J; 모든 마우스는 수컷이었다. 이 방법은 일반적으로 다른 표준 마우스 균주를 사용한 연구에도 적용 가능하다. 이 수술은 함께 일하는 두 사람이 최적으로 수행합니다. 1. 초기 설정 Krebs-Henseleit 전해질 6(25 mM …

Representative Results

간 기능은 주로 산소 소비와 유속으로 평가됩니다. 4-8 mL/min의 유속과 1 μmol/min.g의 산소 소비가 전형적이다. 이러한 측정은 특정 실험 조건 및 생물학적 차이에 따라 달라질 수 있습니다. 사용되는 이소플루란의 정확한 양은 사용되는 마취 시스템의 유형뿐만 아니라 마우스의 환경 및 연령 / 체중에 따라 다릅니다. 수술 동안, 이소플루란 및 전달 가스는 변하지 않지만, 수술 영…

Discussion

이 수술 절차는 도전적이며 재현 가능한 결과를 얻기 위해 광범위한 연습이 필요합니다. 이소플루란과 캐리어 가스는 가능한 한 많은 수술 절차를 통해 동물의 생존력을 유지하기 위해 필요에 따라 조정되어야합니다. 환경, 시간, 나이, 체중 및 기타 여러 요인이 마취에 영향을 미칩니다. 체중,식이 요법, 생쥐의 긴장 및 나이는 지방 축적이 포털 정맥을 시각화하는 것을 방해 할 수 있으므로 수술?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 국립 보건원 (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889)의 기금으로 지원되었습니다. 이 작업의 일부는 국립 과학 재단 협력 협약 No.에 의해 지원되는 국립 고 자기장 연구소의 고급 자기 공명 이미징 및 분광법 (AMRIS) 시설의 McKnight Brain Institute에서 수행되었습니다. DMR-1644779 및 플로리다 주.

Materials

1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe N/A N/A Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column N/A N/A Custom Made
2-0 Silk Suture Braintree Scientific N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety Terumo SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles Exel International 26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles Exel International 26426
4×4 in. Surgical Platform N/A N/A Custom Made
70% Alcohol Wipe N/A N/A Non-specific Brand
Circulating Water Bath MS Lauda N/A Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator N/A N/A Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " Roboz RS-6702
Dumont #5/45 Forceps Fine Scientific Tools 11251-35
Dumont #7 – Fine Forceps Fine Scientific Tools 11274-20
Hemostats Fine Scientific Tools 13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL RX Generics 71288-0402-02
Isoflurane Patterson Veterinary 14043-0704-06
Lidocaine HCl 2% VEDCO Inc. 50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator Radnoti N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " Roboz RS-6013
Oxygen Meter System Hanstech Instruments Ltd. N/A
Saline 0.9% Solution N/A N/A Saline is made in lab
Scale N/A N/A Non-specific Brand
 Variable Speed Analog Console Pump Systems Cole Palmer N/A Models are custom per application
Weigh boats N/A N/A Non-specific Brand

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Cite This Article
Giacalone, A. G., Merritt, M. E., Ragavan, M. Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse. J. Vis. Exp. (181), e63154, doi:10.3791/63154 (2022).

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