Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Entender a fisiologia das sinapses e como elas sofrem alterações plásticas é fundamental para entender como as redes cerebrais funcionam no cérebro saudável¹ e como elas funcionam mal em distúrbios cerebrais. O uso de fatias cerebrais ex vivo agudas permite o registro da atividade elétrica das sinapses de neurônios individuais com uma alta relação sinal-ruído usando gravações de patch clamp de células inteiras. O controle do potencial de membrana e a manipulação farmacológica direta permitem o isolamento dos subtipos de receptores. Esses registros podem ser feitos com requintada especificidade para identificar o neurônio pós-sináptico, incluindo posição laminar e sub-regional², morfologia celular³, presença de marcadores moleculares⁴, suas projeções aferentes⁵, ou mesmo se ele estava recentemente ativo⁶.

Alcançar a especificidade das entradas pré-sinápticas é, no entanto, um pouco mais desafiador. O método convencional tem usado eletrodos de estimulação para excitar os axônios que correm em uma lâmina particular. Um exemplo disso é no hipocampo, onde a estimulação local no estrato radiado ativa sinapses que se projetam do subcampo CA3 ao CA1⁷. Neste caso, a especificidade pré-sináptica é alcançada, pois a entrada CA3 representa a única entrada excitatória localizada dentro do estrato radiado que se projeta para células piramidais CA1⁸. Esse alto grau de especificidade de entrada alcançável com a ativação pré-sináptica elétrica convencional dos axônios CA3-CA1 é, no entanto, uma exceção que se reflete no intenso estudo a que essa sinapse tem sido submetida. Em outras regiões do cérebro, axônios de múltiplas vias aferentes coexistem na mesma lâmina, por exemplo, na camada 1 do neocórtex⁹, tornando impossível a estimulação pré-sináptica específica de entrada com eletrodos estimulantes convencionais. Isso é problemático, pois diferentes entradas sinápticas podem ter propriedades fisiológicas divergentes; portanto, sua co-estimulação pode levar à descaracterização da fisiologia sináptica.

O advento da optogenética, codificação genética de proteínas de membrana fotossensíveis (opsinas), como a canalrodopsina-2 (ChR2), tem permitido uma vasta expansão de possibilidades para o estudo de projeções sinápticas isoladas entre regiões cerebrais^10,11. Aqui descrevemos uma solução generalizável e de baixo custo para estudar a fisiologia sináptica de longo alcance e a plasticidade. Os construtos optogenéticos são entregues de maneira altamente específica usando vetores virais, permitindo um controle extremamente preciso da região pré-sináptica de interesse. Projeções eferentes expressarão o canal ativado pela luz, permitindo a ativação dessas fibras em uma região alvo. Assim, vias anatomicamente difusas de longo alcance que não podem ser ativadas independentemente pela estimulação elétrica tradicional e inespecífica podem ser estudadas.

Descrevemos, como um exemplo de via, a transdução do córtex pré-frontal medial (mPFC) com vírus adenoassociados (AAVs) que codificam opsinas excitatórias de canal catiônico. Em seguida, descrevemos o preparo de cortes agudos do córtex entorrinal lateral (LEC), registros de patch-clamp de neurônios piramidais LEC da camada 5 e ativação evocada por luz de projeções glutamatérgicas mPFC-LEC (Figura 1). Também descrevemos a avaliação histológica do local da injeção para confirmar a localização da região pré-sináptica de interesse e identificação da morfologia celular pós-sináptica.