Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Het begrijpen van de fysiologie van synapsen en hoe ze plastische veranderingen ondergaan, is van fundamenteel belang om te begrijpen hoe hersennetwerken functioneren in de gezonde hersenen¹ en hoe ze niet goed functioneren bij hersenaandoeningen. Het gebruik van acute ex vivo hersensegmenten maakt het mogelijk om de elektrische activiteit van synapsen van afzonderlijke neuronen met een hoge signaal-ruisverhouding te registreren met behulp van patchklemopnamen voor hele cellen. Controle van membraanpotentiaal en eenvoudige farmacologische manipulatie maakt isolatie van receptorsubtypen mogelijk. Deze opnames kunnen met voortreffelijke specificiteit worden gemaakt om het post-synaptische neuron te identificeren, inclusief laminaire en subregionale positie², cellulaire morfologie³, aanwezigheid van moleculaire markers⁴, de afferente projecties⁵, of zelfs als het onlangs actief was⁶.

Het bereiken van specificiteit van pre-synaptische inputs is echter iets uitdagender. De conventionele methode heeft stimulatie-elektroden gebruikt om de axonen te exciteren die in een bepaalde lamina lopen. Een voorbeeld hiervan is in de hippocampus waar lokale stimulatie in het stratum radiatum synapsen activeert die van de CA3 naar het CA1-subveld^{7 projecteren}. In dit geval wordt presynaptische specificiteit bereikt omdat CA3-input de enige exciterende input vertegenwoordigt die zich in stratum radiatum bevindt en projecteert op CA1 piramidale cellen⁸. Deze hoge mate van inputspecificiteit die haalbaar is met conventionele elektrische presynaptische activering van CA3-CA1-axonen is echter een uitzondering die wordt weerspiegeld in de intense studie waaraan deze synaps is onderworpen. In andere hersengebieden bestaan axonen van meerdere afferente paden naast elkaar in dezelfde lamina, bijvoorbeeld in laag 1 van neocortex⁹, waardoor inputspecifieke presynaptische stimulatie onmogelijk wordt met conventionele stimulerende elektroden. Dit is problematisch omdat verschillende synaptische inputs uiteenlopende fysiologische eigenschappen kunnen hebben; daarom kan hun co-stimulatie leiden tot verkeerde karakterisering van synaptische fysiologie.

De komst van optogenetica, de genetische codering van lichtgevoelige membraaneiwitten (opsins) zoals channelrhodopsine-2 (ChR2), heeft een enorme uitbreiding van de mogelijkheden mogelijk gemaakt voor het bestuderen van geïsoleerde synaptische projecties tussen hersengebieden^10,11. Hier beschrijven we een generaliseerbare en goedkope oplossing voor het bestuderen van synaptische fysiologie en plasticiteit op lange afstand. De optogenetische constructen worden op een zeer specifieke manier geleverd met behulp van virale vectoren die een uiterst nauwkeurige controle van het pre-synaptische gebied van belang mogelijk maken. Efferente projecties zullen het door licht geactiveerde kanaal uitdrukken, waardoor deze vezels in een doelgebied kunnen worden geactiveerd. Zo kunnen langeafstands-, anatomisch diffuse paden worden bestudeerd die niet onafhankelijk kunnen worden geactiveerd door traditionele, niet-specifieke, elektrische stimulatie.

We beschrijven, als voorbeeldroute, transductie van mediale prefrontale cortex (mPFC) met adeno-geassocieerde virussen (AAV’s) die coderen voor exciterende kationkanaalopsinen. Vervolgens beschrijven we de bereiding van acute plakjes uit de laterale entorhinale cortex (LEC), patch-clamp opnames van laag 5 LEC piramidale neuronen en lichtgevooleerde activering van glutamaterge mPFC-LEC projecties (Figuur 1). We beschrijven ook de histologische beoordeling van de injectieplaats om de locatie van het pre-synaptische gebied van belang en identificatie van post-synaptische celmorfologie te bevestigen.