שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

גליקוגן מופץ באופן נרחב בטבע, כאשר התרכובת נמצאת בחיידקים, פרוטיסטים רבים, פטריות ובעלי חיים. במיקרואורגניזמים, גליקוגן חשוב להישרדות התאים כאשר חומרי המזון מגבילים, ובאורגניזמים גבוהים יותר כמו יונקים, סינתזה ופירוק של גליקוגן משמשים למאגר רמות הגלוקוז בדם ^1,2,3. חקר חילוף החומרים של גליקוגן הוא, אם כן, בעל חשיבות לתחומים מגוונים כגון מיקרוביולוגיה ופיזיולוגיה של יונקים. הבנת חילוף החומרים של גליקוגן דורשת לחקור את האנזימים העיקריים של סינתזת גליקוגן (גליקוגן סינתאז ואנזים המסתעף) ופירוק גליקוגן (גליקוגן פוספורילאז ואנזים מסתעף). מבחני תקן הזהב של גליקוגן סינתאז, פוספורילאז, הסתעפות ופירוק פעילויות אנזימים משתמשים באיזוטופים רדיואקטיביים. לדוגמה, גליקוגן סינתאז נמדד בדרך כלל בבדיקה רדיוכימית עצורה על ידי שילוב של גלוקוז מ-UDP-[14 C]גלוקוז (במקרה של אנזימים מן החי והפטריות) או ADP-[¹⁴C]גלוקוז (במקרה של אנזימים חיידקיים) לתוך גליקוגן ^4,5. באופן דומה, גליקוגן פוספורילאז נמדד בכיוון של סינתזת גליקוגן, בעקבות שילוב גלוקוז מ[¹⁴C]גלוקוז-1-פוספט לתוך גליקוגן⁶. אנזים ההסתעפות נבדק על ידי מדידת יכולתו של אנזים זה לעורר שילוב של [14 C]גלוקוז מגלוקוז-1-פוספט לשרשראות α1,4 מקושרות על ידי גליקוגן פוספורילאז⁷, ופעילות האנזים המתפרק נקבעת על ידי מעקב אחר יכולתו של האנזים לשלב [¹⁴C]גלוקוז בגליקוגן⁸ . למרות שהם רגישים מאוד, ומאפשרים את השימוש בהם בתמציות תאים גולמיים עם רמות נמוכות של פעילות אנזימים, הסובסטרטים הרדיואקטיביים יקרים וכפופים לדרישות הרגולטוריות הנלוות לשימוש ברדיואיזוטופים. חסמים אלה מציבים את השימוש במבחנים מסוימים מחוץ להישג ידם של עובדים רבים. עם זאת, במשך שנים רבות תואר מגוון מרשים של גישות ספקטרופוטומטריות למדידת אנזימים אלה. באופן כללי, גישות אלה מסתמכות בסופו של דבר על מדידת הייצור או הצריכה של NADH/NADPH, או על יצירת קומפלקסים צבעוניים בין גליקוגן ליוד. לפיכך, הם פשוטים וניתן לבצע אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים פשוטים המצוידים רק במנורות הבזק טונגסטן או קסנון.

בדיקות ספקטרופוטומטריות של גליקוגן סינתאז מסתמכות על מדידת הנוקלאוזיד דיפוספט המשתחרר מתורם נוקלאוטיד הסוכר, כאשר גלוקוז מתווסף לשרשרת הגליקוגן^ההולכת וגדלה ^9,10. הנוהל למדידת פעילות גליקוגן סינתאז המתואר בסעיף 1 לפרוטוקול, להלן, הוא שינוי של זה שתואר על ידי Wayllace et ^al.11, וסכמת הצימוד מוצגת להלן:

(גלוקוז) _n + UPD-גלוקוז → (גלוקוז)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + פוספונולפירובט → פירובט + ATP

פירובט + NADH + H+ → לקטט + NAD⁺

גליקוגן סינתאז מוסיף גלוקוז מ-UDP-גלוקוז על גליקוגן. ה-UDP שנוצר בתהליך זה מומר ל-UTP על ידי נוקלאוזיד דיפוספט קינאז (NDP kinase), בתגובה שיוצרת ADP. ה- ADP, בתורו, משמש כמצע לפירובט קינאז, אשר פוספורילטים את ה- ADP באמצעות פוספונולפירובט כתורם פוספט. הפירובט המתקבל מומר ללקטט על ידי האנזים לקטט דהידרוגנאז בתגובה הצורכת NADH. הבדיקה יכולה, אם כן, להתבצע באופן רציף, תוך מעקב אחר הירידה בספיגה ב 340 ננומטר כמו NADH נצרך. הוא מותאם בקלות לשימוש עם אנזימים הדורשים ADP-גלוקוז כתורם גלוקוז. כאן, שלבי הצימוד פשוטים יותר מכיוון שה-ADP המשתחרר על ידי פעולת הגליקוגן סינתאז מופעל ישירות על ידי פירובט קינאז.

קיימים מגוון מבחנים ספקטרופוטומטריים לקביעת פעילות גליקוגן פוספורילאז. בגרסה הקלאסית, האנזים מונע לאחור, בכיוון של סינתזת גליקוגן, כפי שמוצג להלן:

(גלוקוז) _n + גלוקוז-1-פוספט → (גלוקוז)_n+1 + P_i

במרווחי זמן מתוזמנים מוסרים אליקוטים של תערובת התגובה, וכמות הפוספט המשוחררת מכמתת^12,13. בידינו, בדיקה זו הייתה בשימוש מוגבל בשל נוכחותו של פוספט חופשי הניתן למדידה בקלות בתכשירים מסחריים רבים של גלוקוז-1-פוספט, בשילוב עם הריכוזים הגבוהים של גלוקוז-1-פוספט הדרושים לפעולת פוספורילאז. במקום זאת, השתמשנו באופן שגרתי בבדיקה חלופית המודדת את הגלוקוז-1-פוספט המשתחרר כאשר הגליקוגן מתפרק על-ידי זרחן¹³. נעשה שימוש בסכמת תגובה מצומדת, המומחשת להלן.

(גלוקוז) n + P_i → (גלוקוז)_n-1 + _{גלוקוז-1-פוספט}

גלוקוז-1-פוספט → גלוקוז-6-פוספט

גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH ⁺ H⁺

הגלוקוז-1-פוספט מומר לגלוקוז-6-פוספט על-ידי פוספוגלוקוטאז, והגלוקוז-6-פוספט מתחמצן ל-6-פוספוקונולקטון, עם הפחתה מקבילה של NADP⁺ ל-NADPH. הנוהל המפורט בסעיף 2 לפרוטוקול, להלן, נגזר משיטות שתוארו על ידי Mendicino et al.14 ו- Schreiber & Bowling ¹⁵. הבדיקה יכולה להתבצע בקלות באופן רציף, עם עלייה בספיגה ב 340 ננומטר לאורך זמן, המאפשר את קביעת קצב התגובה.

קביעה ספקטרופוטומטרית של פעילות אנזים מתפרקת מסתמכת על מדידת הגלוקוז המשתחרר על ידי פעולת האנזים על גבול הזרחן דקסטרין¹⁶. תרכובת זו מיוצרת על ידי טיפול ממצה בגליקוגן פוספורילאז. מאחר שפעולת הגליקוגן פוספורילאז עוצרת 4 שאריות גלוקוז מנקודת ענף α1,6, דקסטרין הגבול מכיל גליקוגן, שהשרשראות החיצוניות שלו קוצרו ל~4 שאריות גלוקוז. הכנת דקסטרין גבול הפוספורילאז מתוארת כאן, באמצעות הליך הנגזר מאלו שפותחו על ידי Taylor et al.17 ו- Makino & Omichi ¹⁸.

פירוק הוא תהליך בן שני שלבים. פעילות 4-α-glucanotransferase של אנזים הפירוק הדו-כיווני מעבירה תחילה שלוש שאריות גלוקוז מנקודת הענף לקצה הלא-מצמצם של שרשרת גלוקוז סמוכה α1,4 המקושרת. שאריות הגלוקוז הבודדות המקושרות α1,6 שנותרו בנקודת הענף עוברות הידרוליזה על-ידי פעילות α1,6-גלוקוזידאז¹⁹. הבדיקה מבוצעת בדרך כלל בצורה עצורה, כאשר הגלוקוז משתחרר לאחר זמן נתון (או סדרה של פעמים) נמדד במבחן אנזים מצומד כפי שמוצג להלן:

(גלוקוז) n → (גלוקוז)_n-1 + גלוקוז

גלוקוז + ATP → גלוקוז-6-פוספט + ADP

גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH ⁺ H⁺

קביעת NADPH המיוצר נותן מדד לייצור גלוקוז. הנוהל המתואר בסעיף 3 לפרוטוקול, להלן, מבוסס על הליך שתואר על ידי Nelson et ^al.16. כמו השיטות האחרות המסתמכות על צריכה או ייצור של NADH/NADPH, הבדיקה רגישה למדי. עם זאת, נוכחות של עמילאזות או גלוקוזידאזות אחרות, שיכולות גם לשחרר גלוקוז חופשי מפוספורילאז המגבילות את הדקסטרין, תגרום להפרעות משמעותיות (ראו דיון).

הקביעה הצבעונית של פעילות אנזימי הסתעפות מסתמכת על העובדה ששרשראות α1,4 של גלוקוז מאמצות מבנים סליליים הנקשרים ליוד, ויוצרים קומפלקסים צבעוניים²⁰. צבע הקומפלקס שנוצר תלוי באורך השרשראות המקושרות α1,4. לפיכך, עמילוז, המורכב משרשראות ארוכות, ברובן לא מסותתות, של גלוקוז α1,4 המקושר, יוצר קומפלקס כחול עמוק עם יוד. לעומת זאת, גליקוגנים, שהשרשראות החיצוניות שלהם הן בדרך כלל בסדר גודל של 6 עד 8 שאריות גלוקוז בלבד, יוצרים קומפלקסים כתומים-אדומים. אם תמיסה של עמילוז מודגרת באנזים מסתעף, הכנסת הענפים לתוך העמילוז גורמת ליצירת שרשראות סוכר קצרות יותר α1,4 המקושרות זו לזו. לפיכך, מקסימום הספיגה של קומפלקסי העמילוז/יוד נע לעבר אורכי גל קצרים יותר. ההליך הנדון כאן נגזר מזה שפורט על ידי Boyer & Preiss²¹ ופעילות האנזים המסתעף מכמתת כהפחתה בספיגת קומפלקס העמילוז/יוד ב-660 ננומטר לאורך זמן.

כפי שניתן לראות בקלות מהדיון לעיל, העובדה שצבעי הקומפלקסים הנוצרים בין שרשראות יוד ו-α1,4-גלוקוז משתנים עם אורך השרשרת פירושה שספקטרום הספיגה של קומפלקסים של גליקוגן/יוד צריך להשתנות עם מידת הסתעפות הגליקוגן. זה אכן המקרה, וגליקוגנים/גליקוגנים פחות מסועפים עם שרשראות חיצוניות ארוכות יותר בולעים אור באורך גל ארוך יותר מאשר גליקוגנים מסועפים יותר / בעלי שרשראות חיצוניות קצרות יותר. לפיכך, ניתן להשתמש בתגובת צביעת היוד כדי לקבל נתונים מהירים ואיכותיים על מידת הסתעפות הגליקוגן²². הצבע הכתום-חום נוצר כאשר קומפלקסים גליקוגן עם יוד אינו אינטנסיבי במיוחד. עם זאת, ניתן לשפר את התפתחות הצבע על ידי הכללת תמיסת קלציום כלוריד רוויה²². זה מגביר את הרגישות של השיטה פי 10 ומאפשר ניתוח מוכן של כמויות מיקרוגרם של גליקוגן. הבדיקה לקביעת ההסתעפות המתוארת בסעיף 4 לפרוטוקול, להלן, מותאמת מתוך נוהל שפותח על ידי קריסמן²². הוא מתבצע פשוט על ידי שילוב דגימת הגליקוגן עם תמיסת יוד וסידן כלורי בקובט ואיסוף ספקטרום הספיגה מ 330 ננומטר ל 800 ננומטר. מקסימום הספיגה משתנה לכיוון אורכי גל ארוכים יותר ככל שמידת ההסתעפות יורדת.

באופן קולקטיבי, השיטות המתוארות כאן מספקות אמצעים פשוטים ואמינים להערכת פעילותם של האנזימים המרכזיים של חילוף החומרים של גליקוגן, ולהשגת נתונים איכותיים על היקף הסתעפות הגליקוגן.