الطرق الطيفية لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقي النواة

ينتشر الجليكوجين على نطاق واسع في الطبيعة ، حيث يوجد المركب في البكتيريا والعديد من الطلائعيات والفطريات والحيوانات. في الكائنات الحية الدقيقة ، يكون الجليكوجين مهما لبقاء الخلية عندما تكون العناصر الغذائية محدودة ، وفي الكائنات الحية العليا مثل الثدييات ، يعمل تخليق وتدهور الجليكوجين على تخزين مستويات الجلوكوز في الدم¹،^2،3. وبالتالي ، فإن دراسة استقلاب الجليكوجين لها أهمية في مجالات متنوعة مثل علم الأحياء الدقيقة وعلم وظائف الأعضاء في الثدييات. يتطلب فهم استقلاب الجليكوجين دراسة الإنزيمات الرئيسية لتخليق الجليكوجين (سينسيز الجليكوجين والإنزيم المتفرع) وتدهور الجليكوجين (فسفوريلاز الجليكوجين وإنزيم debranching). تستخدم المقايسات القياسية الذهبية لأنشطة إنزيم الجليكوجين سينسيز ، والفوسفوريلاز ، والتفرع ، وأنشطة الإنزيم المتفرعة نظائر مشعة. على سبيل المثال ، يتم قياس سينسيز الجليكوجين بشكل عام في مقايسة كيميائية إشعاعية متوقفة باتباع دمج الجلوكوز من UDP- [14 C] الجلوكوز (في حالة الإنزيمات الحيوانية والفطرية) أو ADP- [¹⁴C] الجلوكوز (في حالة الإنزيمات البكتيرية) في الجليكوجين ^4,5. وبالمثل ، يتم قياس فسفوريلاز الجليكوجين في اتجاه تخليق الجليكوجين ، بعد دمج الجلوكوز من [¹⁴C] الجلوكوز -1-فوسفات في الجليكوجين⁶. يتم فحص الإنزيم المتفرع عن طريق قياس قدرة هذا الإنزيم على تحفيز دمج [14 C] الجلوكوز من الجلوكوز -1-فوسفات في سلاسل مرتبطة α1،4 بواسطة الجليكوجين فسفوريلاز⁷ ، ويتم تحديد نشاط إنزيم إزالة التفرع باتباع قدرة الإنزيم على دمج [¹⁴C] الجلوكوز في الجليكوجين⁸ . في حين أن الركائز المشعة حساسة للغاية ، مما يسمح باستخدامها في مستخلصات الخلايا الخام ذات المستويات المنخفضة من نشاط الإنزيم ، إلا أنها باهظة الثمن وتخضع للمتطلبات التنظيمية المصاحبة لاستخدام النظائر المشعة. هذه الحواجز تضع استخدام بعض المقايسات بعيدا عن متناول العديد من العمال. ومع ذلك ، على مدار سنوات عديدة ، تم وصف مجموعة متنوعة رائعة من الأساليب الطيفية لقياس هذه الإنزيمات. بشكل عام ، تعتمد هذه الأساليب في نهاية المطاف على قياس إنتاج أو استهلاك NADH / NADPH ، أو توليد مجمعات ملونة بين الجليكوجين واليود. وبالتالي ، فهي واضحة ويمكن تنفيذها باستخدام مقاييس الطيف الضوئي البسيطة المجهزة بمصابيح فلاش التنغستن أو الزينون فقط.

تعتمد المقايسات الطيفية لسينسيز الجليكوجين على قياس ثنائي فوسفات النيوكليوزيد المنطلق من مانح نيوكليوتيدات السكر حيث يضاف الجلوكوز إلى سلسلة الجليكوجين^{المتنامية 9,10}. الإجراء الخاص بقياس نشاط سينسيز الجليكوجين الموصوف في القسم 1 من البروتوكول ، أدناه ، هو تعديل لذلك الذي حدده Wayllace et ^al.11 ، ويظهر مخطط الاقتران أدناه:

(الجلوكوز) _n + UPD-الجلوكوز → (الجلوكوز) _{ن + 1 +} UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + فوسفوينول بيروفات → بيروفات + ATP

بيروفات + NADH + H + → لاكتات ⁺ NAD⁺

يضيف سينثيز الجليكوجين الجلوكوز من UDP-glucose إلى الجليكوجين. يتم تحويل UDP المتولد في هذه العملية إلى UTP بواسطة كيناز ثنائي فوسفات النوكليوزيد (NDP kinase) ، في تفاعل يولد ADP. يعمل جزيء ADP بدوره كركيزة لكيناز البيروفات، الذي يفسفر جزيء ADP باستخدام فوسفوينول بيروفات كمتبرع بالفوسفات. يتم تحويل البيروفات الناتجة إلى لاكتات بواسطة إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات في تفاعل يستهلك NADH. وبالتالي ، يمكن إجراء الفحص بطريقة مستمرة ، ومراقبة انخفاض الامتصاص عند 340 نانومتر عند استهلاك NADH. يتم تكييفه بسهولة للاستخدام مع الإنزيمات التي تتطلب ADP-glucose كمتبرع بالجلوكوز. هنا ، تكون خطوات الاقتران أبسط لأن ADP الصادر عن عمل سينثيز الجليكوجين يعمل عليه مباشرة بواسطة كيناز البيروفات.

هناك مجموعة متنوعة من المقايسات الطيفية المتاحة لتحديد نشاط فسفوريلاز الجليكوجين. في الإصدار الكلاسيكي ، يتم دفع الإنزيم للخلف ، في اتجاه تخليق الجليكوجين ، كما هو موضح أدناه:

(الجلوكوز) _n + الجلوكوز -1-فوسفات → (الجلوكوز) ن + _{1 +} P_i

على فترات زمنية محددة ، تتم إزالة حصص خليط التفاعل ، ويتم تحديد كمية الفوسفات المحررة^12,13. في أيدينا ، كان هذا الفحص ذا فائدة محدودة بسبب وجود فوسفات حر قابل للقياس بسهولة في العديد من المستحضرات التجارية للجلوكوز -1 فوسفات ، جنبا إلى جنب مع التركيزات العالية من الجلوكوز -1 فوسفات اللازمة لعمل الفوسفوريلاز. بدلا من ذلك ، استخدمنا بشكل روتيني مقايسة بديلة تقيس الجلوكوز 1-فوسفات المنطلق عندما يتحلل الجليكوجين بواسطة فسفوريلاز¹³. يتم استخدام مخطط تفاعل مقترن ، موضح أدناه.

(الجلوكوز) n + P_i → (جلوكوز) _n-1 + جلوكوز –_{1-فوسفات}

جلوكوز-1-فوسفات → جلوكوز-6-فوسفات

جلوكوز-6-فوسفات + NADP+ → 6-فوسفوغلوكونولاكتون + NADPH + H⁺

يتم تحويل الجلوكوز-1-فوسفات إلى جلوكوز-6-فوسفات بواسطة فوسفوغلوكوموتاز ، ثم يتأكسد الجلوكوز-6-فوسفات إلى 6-فوسفوغلوكونولاكتون ، مع ما يصاحب ذلك من اختزال NADP ⁺ إلى NADPH. الإجراء المفصل في القسم 2 من البروتوكول ، أدناه ، مشتق من الطرق التي وصفها Mendicino et al.14 و Schreiber & Bowling¹⁵. يمكن إجراء الفحص بسهولة بطريقة مستمرة ، مع زيادة الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت ، مما يسمح بتحديد معدل التفاعل.

يعتمد التحديد الطيفي لنشاط إنزيم debranching على قياس الجلوكوز المنبعث من عمل الإنزيم على حد الفوسفوريلاز دكسترين¹⁶. يتكون هذا المركب عن طريق معالجة الجليكوجين بشكل شامل مع فسفوريلاز الجليكوجين. نظرا لأن عمل فسفوريلاز الجليكوجين يوقف 4 بقايا جلوكوز بعيدا عن نقطة α1,6 ، فإن الدكسترين الحد يحتوي على الجليكوجين ، وقد تم تقصير السلاسل الخارجية إلى ~ 4 بقايا جلوكوز. يوصف هنا تحضير دكسترين حد الفوسفوريلاز ، باستخدام إجراء مشتق من تلك التي طورها Taylor et al.17 و Makino & Omichi¹⁸.

التفكيك هو عملية من خطوتين. ينقل نشاط 4-α-glucanotransferase لإنزيم debranching ثنائي الوظيفة أولا ثلاثة بقايا جلوكوز من نقطة الفرع إلى الطرف غير المختزل لسلسلة جلوكوز α1,4 مرتبطة قريبة. ثم يتم تحلل بقايا الجلوكوز المرتبطة α1,6 المتبقية عند نقطة الفرع بواسطة نشاط α1,6-glucosidase¹⁹. عادة ما يتم إجراء الفحص بطريقة متوقفة ، حيث يتم قياس الجلوكوز المنطلق بعد وقت معين (أو سلسلة من الأوقات) في مقايسة إنزيم مقترنة كما هو موضح أدناه:

(الجلوكوز) ن → (جلوكوز) _ن-1 + جلوكوز

الجلوكوز + ATP → الجلوكوز-6-فوسفات + ADP

جلوكوز-6-فوسفات + NADP+ → 6-فوسفوغلوكونولاكتون + NADPH + H⁺

يعطي تحديد NADPH المنتج مقياسا لإنتاج الجلوكوز. ويستند الإجراء المبين في القسم 3 من البروتوكول أدناه إلى إجراء وصفه نيلسون وآخرون.16. مثل الطرق الأخرى التي تعتمد على استهلاك أو توليد NADH / NADPH ، فإن الفحص حساس للغاية. ومع ذلك ، فإن وجود الأميليز أو الجلوكوزيداز الأخرى ، والتي يمكن أن تحرر أيضا الجلوكوز الحر من دكسترين حد الفوسفوريلاز ، سوف يسبب تداخلا كبيرا (انظر المناقشة).

يعتمد التحديد اللوني لنشاط الإنزيم المتفرع على حقيقة أن سلاسل الجلوكوز المرتبطة ب α1,4 تتبنى هياكل حلزونية ترتبط باليود ، وتشكل مجمعات ملونة²⁰. يعتمد لون المجمع المتشكل على طول السلاسل المرتبطة α1,4. وبالتالي ، فإن الأميلوز ، الذي يتكون من سلاسل طويلة غير متفرعة إلى حد كبير من الجلوكوز المرتبط ب α1,4 ، يشكل مركبا أزرق عميقا مع اليود. في المقابل ، تشكل الجليكوجينات ، التي تكون سلاسلها الخارجية بشكل عام في حدود 6 إلى 8 بقايا جلوكوز فقط ، مجمعات برتقالية حمراء. إذا تم تحضين محلول الأميلوز بإنزيم متفرع ، فإن إدخال الفروع في الأميلوز يؤدي إلى توليد سلاسل جلوكوز مرتبطة α1,4 أقصر. وبالتالي ، فإن الحد الأقصى لامتصاص مجمعات الأميلوز / اليود يتحول نحو أطوال موجية أقصر. الإجراء الذي تمت مناقشته هنا مشتق من الإجراء المفصل بواسطة Boyer & Preiss²¹ ويتم تحديد نشاط الإنزيم المتفرع كميا على أنه انخفاض في امتصاص مركب الأميلوز / اليود عند 660 نانومتر بمرور الوقت.

كما ينبغي أن يكون واضحا بسهولة من المناقشة أعلاه ، فإن حقيقة أن ألوان المعقدات التي تشكلت بين سلاسل اليود والجلوكوز α1,4 تختلف باختلاف طول السلسلة تعني أن أطياف الامتصاص لمجمعات الجليكوجين / اليود يجب أن تختلف مع درجة تفرع الجليكوجين. هذا هو الحال بالفعل ، وتمتص الجليكوجينات / الجليكوجينات الأقل تشعبا ذات السلاسل الخارجية الأطول الضوء بطول موجي أطول من الجليكوجينات الأكثر تشعبا / لها سلاسل خارجية أقصر. لذلك يمكن استخدام تفاعل تلطيخ اليود للحصول على بيانات نوعية سريعة عن درجة تفرع الجليكوجين²². يتشكل اللون البرتقالي والبني عندما لا تكون مجمعات الجليكوجين مع اليود شديدة بشكل خاص. ومع ذلك ، يمكن تعزيز تطوير اللون من خلال إدراج محلول كلوريد الكالسيوم المشبع²². هذا يعزز حساسية الطريقة حوالي 10 أضعاف ويسمح بتحليل جاهز لكميات ميكروغرام من الجليكوجين. تم تكييف مقايسة تحديد التفرع الموصوفة في القسم 4 من البروتوكول أدناه من إجراء طوره Krisman²². يتم إجراؤه ببساطة عن طريق الجمع بين عينة الجليكوجين ومحلول اليود وكلوريد الكالسيوم في كوفيت وجمع طيف الامتصاص من 330 نانومتر إلى 800 نانومتر. يتحول الحد الأقصى للامتصاص نحو أطوال موجية أطول مع انخفاض درجة التفرع.

بشكل جماعي ، توفر الطرق الموضحة هنا وسائل بسيطة وموثوقة لتقييم أنشطة الإنزيمات الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين ، وللحصول على بيانات نوعية عن مدى تفرع الجليكوجين.