Monitoramento em tempo real da respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas
Summary
A adaptação metabólica é fundamental para as células T, pois dita diferenciação, persistência e citotoxicidade. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para monitorar a respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas ex vivo .
Abstract
Durante a ativação, o metabolismo das células T se adapta a mudanças que impactam seu destino. Um aumento da fosforilação oxidativa mitocondrial é indispensável para a ativação celular T, e a sobrevivência das células T da memória depende da remodelagem mitocondrial. Consequentemente, isso afeta o resultado clínico a longo prazo das imunoterapias contra o câncer. Mudanças na qualidade das células T são frequentemente estudadas pela citometria de fluxo usando marcadores superficiais bem conhecidos e não diretamente pelo seu estado metabólico. Este é um protocolo otimizado para medir a respiração mitocondrial em tempo real de células T humanas primárias usando um Analisador de Fluxo Extracelular e as citocinas IL-2 e IL-15, que afetam de forma diferente o metabolismo das células T. Mostra-se que o estado metabólico das células T pode ser claramente distinguido medindo o consumo de oxigênio ao inibir os principais complexos na via metabólica e que a precisão dessas medidas é altamente dependente da ótima concentração inibidora e estratégia de injeção inibidora. Este protocolo padronizado ajudará a implementar a respiração mitocondrial como um padrão para o condicionamento celular T no monitoramento e estudo de imunoterápicos cancerígenos.
Introduction
O desenvolvimento e a função correta das células T são essenciais para a capacidade do sistema imunológico de reconhecer e responder a antígenos. A fosforilação oxidativa mitocondrial (OxPhos) muda de acordo com o estado da célula T. As células T ingênuas usam predominantemente OxPhos para produzir ATP, enquanto as células T ativadas passam por uma transição metabólica onde a glicólise se torna dominante1. Após a fase do efeito, o pequeno subconjunto remanescente de células T de memória reverte para um estado metabólico dominado por OxPhos2,3. As mudanças de OxPhos seguem a diferenciação das células T a tal ponto que até mesmo subconjuntos de células T podem ser diferenciados por suas propriedades específicas é as propriedades OxPhos1. Por outro lado, o OxPhos é importante para a função das células T, e a inibição do OxPhos tem sido demonstrada para bloquear a proliferação e a citocina das células T4. Portanto, a capacidade de quantificar as propriedades do OxPhos da célula T de forma precisa e reprodutível é uma ferramenta poderosa para quem trabalha com células T.
Neste protocolo, as propriedades dos OxPhos da célula T são medidas usando um analisador de fluxo extracelular. A função central deste analisador é medir continuamente o teor de oxigênio das mídias de crescimento das células a serem analisadas. Acredita-se que o oxigênio removido da mídia de crescimento seja tomado pelas células. Ao tratar as células com uma variedade de inibidores ou modificadores oxphos, uma queda na captação de oxigênio está associada à função inibida ou modulada. Por exemplo, a inibição da synthase ATP levará a uma absorção celular reduzida de oxigênio que de outra forma seria usado para produzir ATP por fosforilação oxidativa. Outros equipamentos, incluindo o eletrodo Clark e o instrumento Oroboros, oferecem funcionalidade semelhante, e cada instrumento tem diferentes vantagens e deficiências. Uma ampla gama de tipos de células pode ser usada para estudos nesses dispositivos, mas um tipo particularmente desafiador de células é o linfócitos T primários humanos5. Devido ao seu pequeno tamanho, má sobrevivência ex vivo e propriedades não aderentes, as células T primárias humanas podem ser desafiadoras para estudar.
Este é um protocolo para estudar a respiração mitocondrial das células T primárias humanas por um analisador extracelular. O protocolo é dividido em uma corrida de otimização, onde são determinadas concentrações ideais de número celular por bem, bem como a concentração ideal de oligomicina e FCCP. Além disso, uma corrida de ensaio, onde as condições otimizadas são usadas.
Usando PBMCs humanos derivados do sangue e culturas primárias de células T ex vivo , este protocolo demonstra a importância da concentração inibidora ideal e a relevância do uso separado em vez de uma injeção sequencial de inibidores mitocondriais ao trabalhar com tipos celulares sensíveis. Finalmente, demonstra-se que este ensaio pode detectar robustamente diferenças sutis na respiração mitocondrial após a polarização com citocinas IL-2 e IL-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificação detalhada e correta da fosforilação oxidativa é uma ferramenta indispensável ao descrever os estados energéticos das células T. O estado de aptidão mitocondrial pode estar diretamente relacionado ao potencial de ativação de células T, sobrevivência e diferenciação1,5. Com este protocolo, é possível determinar as várias propriedades da fosforilação oxidativa (ver Tabela 4 para uma explicação detalhada). A quanti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard e Anne Rahbech receberam subsídios de Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard também recebeu uma bolsa de Børnecancerfonden.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
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