Monitoraggio in tempo reale della respirazione mitocondriale in cellule T primarie umane graduate differenziate con citochine
Summary
L’adattamento metabolico è fondamentale per le cellule T in quanto detta differenziazione, persistenza e citotossicità. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per il monitoraggio della respirazione mitocondriale in cellule T primarie umane differenziate ex vivo con citochine.
Abstract
Durante l’attivazione, il metabolismo delle cellule T si adatta ai cambiamenti che influenzano il loro destino. Un aumento della fosforilazione ossidativa mitocondriale è indispensabile per l’attivazione delle cellule T e la sopravvivenza delle cellule T della memoria dipende dal rimodellamento mitocondriale. Di conseguenza, ciò influisce sull’esito clinico a lungo termine delle immunoterapie contro il cancro. I cambiamenti nella qualità delle cellule T sono spesso studiati dalla citometria a flusso utilizzando marcatori di superficie ben noti e non direttamente dal loro stato metabolico. Questo è un protocollo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale in tempo reale delle cellule T umane primarie utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare e le citochine IL-2 e IL-15, che influenzano in modo diverso il metabolismo delle cellule T. È dimostrato che lo stato metabolico delle cellule T può essere chiaramente distinto misurando il consumo di ossigeno quando si inibiscono complessi chiave nella via metabolica e che l’accuratezza di queste misurazioni dipende fortemente dalla concentrazione ottimale di inibitori e dalla strategia di iniezione degli inibitori. Questo protocollo standardizzato aiuterà a implementare la respirazione mitocondriale come standard per l’idoneità delle cellule T nel monitoraggio e nello studio delle immunoterapie contro il cancro.
Introduction
Il corretto sviluppo e la funzione delle cellule T sono essenziali per la capacità del sistema immunitario di riconoscere e rispondere agli antigeni. La fosforilazione ossidativa mitocondriale (OxPhos) cambia in base allo stato della cellula T. Le cellule T naïve utilizzano prevalentemente OxPhos per produrre ATP, mentre le cellule T attivate subiscono una transizione metabolica in cui la glicolisi diventa dominante1. Dopo la fase effettrice, il piccolo sottoinsieme rimanente di cellule T di memoria ritorna ad uno stato metabolico dominato da OxPhos2,3. I cambiamenti di OxPhos seguono la differenziazione delle cellule T a tal punto che anche sottoinsiemi di cellule T possono essere differenziati dalle loro proprietà specifiche di OxPhos1. Al contrario, OxPhos è importante per la funzione delle cellule T e l’inibizione di OxPhos ha dimostrato di bloccare la proliferazione e la produzione di citochine delle cellule T4. Pertanto, la capacità di quantificare le proprietà delle cellule T OxPhos in modo preciso e riproducibile è uno strumento potente per chiunque lavori con le cellule T.
In questo protocollo, le proprietà delle cellule T OxPhos sono misurate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. La funzione principale di questo analizzatore è quella di misurare continuamente il contenuto di ossigeno dei mezzi di crescita delle cellule da analizzare. Si presume che l’ossigeno rimosso dai mezzi di crescita sia assorbito dalle cellule. Trattando le cellule con una varietà di inibitori o modificatori di OxPhos, un calo dell’assorbimento di ossigeno è associato alla funzione inibita o modulata. Ad esempio, l’inibizione dell’ATP sintasi porterà ad un ridotto assorbimento cellulare di ossigeno che altrimenti verrebbe utilizzato per produrre ATP mediante fosforilazione ossidativa. Altre apparecchiature, tra cui l’elettrodo Clark e lo strumento Oroboros, offrono funzionalità simili e ogni strumento presenta vantaggi e carenze diversi. Una vasta gamma di tipi di cellule può essere utilizzata per studi in questi dispositivi, ma un tipo di cellula particolarmente impegnativo sono i linfociti T primari umani5. A causa delle loro piccole dimensioni, della scarsa sopravvivenza ex vivo e delle proprietà non aderenti, le cellule T primarie umane possono essere difficili da studiare.
Questo è un protocollo per studiare la respirazione mitocondriale delle cellule T primarie umane mediante un analizzatore extracellulare. Il protocollo è diviso in una corsa di ottimizzazione, in cui vengono determinate le concentrazioni ottimali di numero di cellule per pozzo, nonché la concentrazione ottimale di oligomicina e FCCP. Inoltre, viene eseguito un test, in cui vengono utilizzate le condizioni ottimizzate.
Utilizzando PBMC umane derivate dal sangue e colture di cellule T primarie ex vivo , questo protocollo dimostra l’importanza della concentrazione ottimale di inibitori e la rilevanza dell’uso separato anziché di un’iniezione sequenziale di inibitori mitocondriali quando si lavora con tipi di cellule sensibili. Infine, è dimostrato che questo test può rilevare in modo robusto sottili differenze nella respirazione mitocondriale dopo polarizzazione con citochine IL-2 e IL-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
La quantificazione dettagliata e corretta della fosforilazione ossidativa è uno strumento indispensabile quando si descrivono gli stati energetici delle cellule T. Lo stato di idoneità mitocondriale può essere direttamente correlato al potenziale di attivazione delle cellule T, alla sopravvivenza e alla differenziazione1,5. Con questo protocollo è possibile determinare le varie proprietà della fosforilazione ossidativa (vedi Tabella 4 per un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard e Anne Rahbech hanno ricevuto sovvenzioni da Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard ha anche ricevuto una sovvenzione da Børnecancerfonden.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
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