マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

iPSC生成およびMAB収穫のためにサンプルを提供したすべての被験者から書面によるインフォームド・コンセントが得られました。この手続きは、大学病院ルーヴェンの医療倫理委員会(n° S5732-ML11268)とStemBANCCプロジェクトの一環として英国の主要研究倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての試薬および装置は 、材料表 に記載されており、滅菌を使用する必要があります。特に明記されていない限り、使用前にメディアを室温(RT)に加熱する必要があります。共カルチャー プロトコルの概要については、 図 1 を参照してください。 1. iPSCからの運動ニューロン前駆物質の分化 運動ニューロン分化プロトコル15に従い、以前の研究16から適応し、10日目の神経前駆物質(NPC)状態に達するまで。プロトコルの時間枠に従って、分化は月曜日(0日目)に開始され、木曜日には10日目のNPCになります。 クライオプション10日目NPCは、1バイアルあたり2 x 106-4 x 106 細胞の密度で10%ジメチルスルホキシド(DMSO)とのノックアウト血清置換術を行う。注意:DMSOは有毒です:個人的な保護具とヒュームフードでハンドル。注:1日の約50%は、解凍時に10台のNPCが不可欠であると予想されています。この「10日NPC」状態で運動ニューロン分化プロトコルを停止し、NPCを凍結保存して多数のNPCを生成し、後でバンクして使用することができ、共培養プロトコルの全体的なタイムラインの長さを合計28日から19日に短縮します。 2. ヒトMABsの導出と維持 注:MABは血管関連間葉系幹細胞であり、この場合、58歳の健康ドナーから得られた生検から採取されています。代替の商業ソースが利用可能です。MABs を取得するためのプロトコルについて簡単に説明します。詳細については、詳細なプロトコル17を参照してください。すべてのMAB培地は、使用前に37°Cに加熱する必要があります。 生検組織をミンチし、コラーゲン(カーフスキンから)にインキュベートし、6cmの皿を成長培地(表1)で2週間コーティングした。4日ごとにメディアを変更します。 コラーゲンコーティングを調製するには、0.1Mの酢酸の20mLにコラーゲン100mgを溶解します。コラーゲンは溶解するのに時間がかかるので、RTで一晩ロッキングプラットフォーム上に混合物を置きます。翌日、80 mLのddH2Oを上げて最終容積100mLにアップ。注意:酢酸は有毒です。個人的な保護具が付いている煙のフードのハンドル。注:カーフスキンコーティングのコラーゲンは5倍まで再利用できます。4 °Cで保管。 皿またはフラスコの表面全体にコラーゲンをコーティングし、ラミナーフロー内のRTで20分間閉じてインキュベートします。20分後、新鮮な容器にコラーゲンを回収し、空の皿/フラスコを閉じ、積層流れのRTで10分間放置します。 皿/フラスコをインキュベーターに一晩(または少なくとも6時間)インキュベート(37°C、5%CO2)に移します。メッキ細胞の前にカルシウムまたはマグネシウム(DPBS)なしでDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水で5倍洗浄します。 14日後、FACS(蛍光活性化細胞選別)は、ヒトアルカリホスファターゼ17 のMABsをソートし、続いてさらに拡張します。コラーゲンコーティングされたT75フラスコのMABsを成長培地に維持し、2日ごとに成長培地を変化させます(1フラスコあたり10 mL)。 70%合流に達するとデバイス内の凍結保存、通過、または播種MAB。注意: MABsは細胞間接触時の自発的な融合のために筋原性の潜在能力を失う。MABs を拡張する場合は、70% を超えないようにしてください。コンフルエントT75フラスコ1個は約60万~80万個の細胞を含み、バイアルあたり10万個の細胞で凍結保存することができます。各バイアルは、後で解凍し、拡張のためにT75フラスコに播種することができます。 MABを通過させるために、DPBSの7 mLで1回静かに洗浄し、MAB解離液の7 mLで3min3 min 3 7 minの5%CO2のCO2 で細胞を解離します。 7 mLの増殖培地でMAB解離液を中和し、細胞を軽く掻き取り、細胞懸濁液を50 mL遠心分離管に移します。フラスコを成長培地の余分な5 mLで静かに洗い、潜在的に残っているMABを収集します。 300 x gで3分間の細胞懸濁液を遠心分離し、その後、拡張のために新しいコラーゲンコーティングT75フラスコに直接通過し、10%DMSOでノックアウト血清置換術中の凍結保存するか、マイクロ流体装置で播種するカウントする。注:13の最大通過数まで、セル拡張の場合、1週間に1x-2xの通路が実行されます。解離すると、MABsは顕微鏡下で調べると球状で大きな形状に見えます。 3. 組み立て済みマイクロ流体デバイスの調製 – 9日目 注:このプロトコルは、マイクロ流体デバイスメーカーのニューロンデバイスプロトコルから適応され、組み立て済みデバイスとシリコーンデバイスの両方を使用するように調整されています。ここでは、あらかじめ組み立てられたデバイスが免疫細胞化学(ICC)および生細胞カルシウム過渡記録に使用され、シリコーンデバイスはSEMに使用されます。プロトコルのタイムラインは、運動ニューロン分化プロトコルのタイムラインに従います。 コーティングが一晩インキュベートする必要があるように、細胞を播種する前日にマイクロ流体デバイスを準備します。運動ニューロンプロトコルによると、これは水曜日になります。70%~100%のエタノールを10cmのペトリ皿に10mL程度加えます。鉗子を使用して、デバイスを輸送コンテナからペトリ皿に移して滅菌します。 装置をエタノールに10 sで沈め、鉗子で装置を紙に移し、30分間の層流で空気乾燥する。デバイスを数回反転させて、両面を乾かします。装置が乾燥しているときは、各デバイスを個々の10cmのペトリ皿に移動させ、容易に取り扱うために鉗子を使用する注意: エタノールは有毒です。個人的な保護具が付いている煙のフードのハンドル ポリL-オルニチン(PLO)(100 μg/mL)をDPBSでコーティングし、37°C、5%CO2 で3時間インキュベートします。 P200ピペットを使用して、DPBSの100 μLを上部に加え、チャネル開口部にできるだけ近く、上から下の井戸を通って流れる流体を観察します。その後、DPBSで100 μLのPLOを底部に加えます。 マイクログルーブの反対側で繰り返し、デバイスの片側に100 μLを追加して、マイクログルーブ(例えば、右側200 μL、左側300 μL)をコーティングするためにデバイスの2つのミラー面の間にボリューム勾配を作成して終了します。3時間後、デバイス3倍をDPBSで5分間洗います。必要に応じて吸引システムを使用してください。注:細胞のコーティングまたは培養中の任意の時点でチャネルに気泡の形成を避けるようにしてください。小さな気泡でも短時間で膨張し、コーティング、細胞の播種、または媒体流れを抑制します。コーティング中に流路で流体が停止した場合は、PLO溶液を両側から直接チャネルに再中断します。気泡がまだ存在する場合は、200 μL の DPBS を使用してチャネルをフラッシュし、上記の手順 3.3.1 ~3.3.2 で説明したコーティングプロセスを繰り返します。セルのシード処理後に泡が現れた場合、チャネルをフラッシュすると細胞が損傷するので、デバイスを回復することは不可能です。 装置にラミニン(20 μg/mL)を神経基底培地に塗布し、37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。手順 3.3.1~3.3.2 の PLO コーティングの手順と同じ手順に従います。 翌日、P200ピペットを使用し、先端をチャネル開口部とは正反対に配置して、ウェルからラミニンコーティングを除去します。DPBSをすべてのウェルに追加し、セルシード用のRTで層流にDPBSを持つデバイスを残します。注:この時点から、気泡形成の原因となる可能性があるため、液体(ラミニンコーティング、DPBS、メディア、固定液など)を直接取り除かないようにすることが重要です。細胞を播種する前に、必ず顕微鏡下でデバイスを検査してください。 4. シリコーンマイクロ流体デバイスの調製 – 9日目 コーティングが一晩インキュベートする必要があるので、細胞を播種する前日にシリコーンマイクロ流体デバイスを準備します。運動ニューロンプロトコルによると、これは水曜日になります。 70%~100%のエタノールを10cmのペトリ皿に10mL程度加えます。鉗子を使用して、デバイスを輸送コンテナからペトリ皿に移して滅菌します。装置をエタノールに10 s浸し、鉗子を6ウェルプレートのウェルに移し、層流で30分間空気乾燥します。装置を側面に置いて、すべての側面が乾燥できるようにします。 SEMシートをデバイスのサイズに切り詰めます(両側に数mm残します)。手順 4.1.1 で前述したように、殺菌を繰り返します。その後、鉗子で10cmのペトリ皿に移して乾燥させる。2~3枚のSEMシートが1皿に収まります。 デバイスとSEMシートに、DPBSでPLO(100 μg/mL)をコーティングし、37°C、5%のCO2 で3時間インキュベートします。 6ウェルプレートの各デバイスに、DPBSあたり1mLのPLOを追加します。デバイスが、チャネルとマイクログルーブ側が液体に向いているPLOソリューションの上に浮かんでいるかどうかを確認します。10 cmのペトリ皿あたりDPBSに10mLのPLOを加え、鉗子を使用してSEMシートを液体に押し込みます。注:SEMシートは通常、コーティング溶液の上に浮かびます。装置およびシートを組み立てる前に、PLOと接触した表面が装置のチャネルおよびマイクロ溝表面に接触するように、SEMシートを回して下さい。 3時間後、デバイスとSEMシート2xをDPBSで5分間洗い、続いて滅菌水で5分間別の洗浄を行います。必要に応じて吸引システムを使用してください。各SEMシートを個別の10cmペトリ皿に移し、取り扱いが容易です。メモ:デバイスとSEMシートの両方が、組み立てる前に完全に乾燥している必要があります。滅菌水による最後の洗浄は、DPBSから潜在的な塩結晶を除去し、そうでなければ組み立てを阻害する可能性がある。 層流で顕微鏡で働く。鉗子を使用して、チャネルとマイクログルーブ側を90°の角度でSEMシートに取り付け、すべての側面が整列していることを確認します。デバイスを軽く押し下げて、外縁だけでなく、井戸、チャネル、マイクログルーブの周りも確実に密封します。注:ボンドされた領域は灰色で表示され、まだ取り付けられていない領域は顕微鏡下でクリア表示されます。培養中に装置の剥離を避けるために、すべての領域が気泡なしで十分に密閉されていることを確認してください。破片や塩結晶が土台を遮断する場合は、SEMシートとデバイスの両方を滅菌水で再洗浄し、取り付け手順を再試行する前に乾燥させます。マイクロ溝がデバイスで強く押しすぎないように見える場合は、SEMシートからデバイスを完全に取り外して、再度取り付けを試してください。装置が取り付けられたら、コーティングや交換媒体の際は注意が必要です。 層流で顕微鏡で働く。装置にラミニン(20 μg/mL)を神経基底培地に塗布し、37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。注:一晩インキュベーションはシリコーン装置を堅くし、さらにSEMシートにそれを密封する。 P200ピペットを使用して、ラミニン溶液の100 μLを可能な限りチャネル開口部に近づけ、上部ウェルから下部ウェルに流れる流体を観察します。井戸とチャネルの周りの漏れがないか確認してください。 その後、100 μL のラミニン溶液を底面ウェルに加え、漏れがないか確認します。マイクログルーブの反対側で繰り返し、デバイスの片側に100 μLを追加して、マイクログルーブ(例えば、右側200 μL、左側300 μL)をコーティングするためにデバイスの2つのミラー面間にボリューム勾配を作成します。注:漏れた場合は、ラミニンコーティングを取り外し、デバイスとSEMシートを分解し、両方を滅菌水で洗浄します。それらを乾燥させ、ステップ4.3以降に繰り返します。 翌日、P200ピペットでウェルからコーティングを取り除き、先端をチャネル開口部の反対側に配置します。DPBSをすべてのウェルに追加し、セルシード用のRTで層流にDPBSを持つデバイスを残します。注:この時点から、気泡の形成を引き起こす可能性があるため、チャネルから直接液体(ラミニンコーティング、DPBS、メディア、固定溶液など)を除去しないでください。細胞を播種する前に、必ず顕微鏡下でデバイスを検査してください。 マイクロ流体デバイスにおけるNPCのめっき – 10日目 注:運動ニューロン分化プロトコル15によると、10日目のNPCのめっきは木曜日に発生します。 解約10日目のNPC15、または10日目の運動ニューロン培地10mL当たりのバンクNPCの1-2バイアル(表2および表3)をROCK阻害剤(10μL/mL)溶液で解凍し、細胞懸濁液を100xgで遠心分離して4分間使用する。 ROCKインヒビター(10 μL/mL)溶液を用いて500-1000μLの運動ニューロン培地で細胞ペレットを再懸濁し、好ましい計数法を用いて生細胞をカウントします。注: 以下に述べられているように、最適なシード ボリュームに対応するために、NPC を適切な量のメディアに再中断してください。 P200ピペットを備えたデバイスのマイクログルーブの片側にある2つのウェルからDPBSを取り外し、10日目の運動ニューロンメディアの60〜100 μLでデバイスあたり250,000 NPCをシードします。 右上のウェルでは、45°の角度でチャネル開口部に近い細胞懸濁液(125,000細胞)のシード30〜50μLを、ピペットチップでウェルの中央に向かってウェルフロアに沿って残りの流体を穏やかにドラッグします。 数秒間一時停止して、セルの懸濁液がチャネルを流れ、下層ウェル(30~50 μLの125,000セル)で繰り返します。ペンを使用して、顕微鏡なしでデバイスの向きを容易にするために、シード側「NPC」または同等のマークを付けます。 37°Cでデバイスをインキュベートし、5分間5%CO2 で細胞の取り付けが可能な場合は、追加の10日目の運動ニューロン培地(合計200μL/well)で2種のウェルをトッピングし、37°C、5%CO2で再びインキュベートします。注:各ウェルには200 μLを含めることができます。ウェルとチャネルの両方に細胞を播種すると、培養物の堅牢な構造が保証され、メディアの変更時に細胞が剥離するリスクが低くなります。チャネル内でシードするセルの数を減らすことも可能です。ただし、これにより、各メディアの変更中にチャネルを通じてボリューム電流に影響を受けやすくなります。 P200ピペットを使用して、新たに播種されたNPCの反対側にあるマイクログルーブの反対側にある2つの井戸からDPBSを取り除きます。次に、インキュベーション中の培地の蒸発を防ぐために、装置の周囲に10cm皿あたり6mLのDPBSを加えます。注: 必要に応じて、カルチャ期間中にデバイスの周囲に DPBS を追加します。 11日目(金曜日)、14日目(月曜日)、16日目(水曜)(表2 および 表3)の両方の区画で、完全運動ニューロン培地の変化を行う。メディア変更の日に新鮮なメディアのサプリメントを追加します。注: この時点から、P200 ピペットを使用してすべてのメディア変更を実行します。常にピペットチップを溝から井戸の端に置き、チャネルから直接液体を取り除かないでください。シリコーンデバイスを取り外さないように注意してください。セルの剥離を防ぐために、メディアの除去と追加はゆっくりと行う必要があります。 P200ピペットチップをチャネル開口部の反対側のウェルウォールの下端に配置して、両方のウェル内のすべてのメディアをNPCで慎重に取り外します。P200ピペットチップをチャネル開口部の反対側のウェルウォールの上端に配置することで、50-100 μLの新鮮な運動ニューロン媒体を上ウェルにゆっくりと加えます。 数秒間一時停止して、メディアがチャネルを流れ、50-100 μLの運動ニューロン媒体を底部に追加します。両方のウェルに200 μL/wellが含まれるまで、このプロセスを慎重に繰り返します。セルなしで側で繰り返します。 6. マイクロ流体デバイスにおけるMABのめっき – 17日目 MABをマイクロ流体デバイス(運動ニューロン分化10日目)に播種する約7日前に、MABsを解凍し、十分な細胞拡張を可能にするために、コラーゲンでコーティングされたT75フラスコの成長培地(表1)に播種します。セクション2を参照してください。 運動ニューロン分化の17日目(木曜日)に、ステップ2.4で説明したようにMABsを解約し、細胞ペレットを増殖培地〜500μL〜500μLで再懸濁し、任意の好ましい計数法を用いて生細胞をカウントする。注: 以下に述べられているように、最適なシード ボリュームに対応するために、必ず正しい量のメディアに MAB を再中断してください。 P200ピペットを使用してデバイス内のマイクログルーブの未播種側の運動ニューロン培地を取り出し、DPBSで穏やかに洗浄し、60〜100μLの成長培地でデバイスあたり200,000 MABをシードします。 右上の井戸では、45°の角度でチャネル開口部に近い細胞懸濁液(100,000細胞)のシード30〜50 μLを、ピペットチップでウェルフロアの中央に向かってそっと引きずります。数秒間一時停止して、チャネルを通る細胞の流れを可能にしてから、下層ウェル(30~50 μLの100,000個のセル)を繰り返します。 37°Cでデバイスをインキュベートし、5分間5%CO2 で細胞の取り付けが可能な後、2つの新しいMABシードの井戸に成長培地(合計200 μL/well)を加えます。37°C、5%CO2で再びインキュベートする。メモ:デバイスの運動ニューロン側の17日目にメディアの変更は必要ありません。前に公表された運動ニューロン分化方法15 による17日目の培地変化は、代わりに18日目(金)に行われる。 7. MABコンパートメントに向かって運動ニューロン神経ニューライトの成長を促進するための容積および化学式勾配の実施 18日目に、18日目の運動ニューロン培地(200 μL/well)で運動ニューロン側で完全な培地変化を行います。手順 5.5.1~5.5.2 で説明されている中程度の変更に関する指示に従います。デバイスの MAB コンパートメントで MAB の分化を開始します (表 2 および 表 4)。 MABコンパートメントをDPBSで1回慎重に洗浄してから、予熱したMAB分化培地(表4)に0.01 μg/mLのヒトアグリン(200 μL/well)を加えます。注:MABsは1週間の間に多核のミオチューブを融合し、形成します。 21日目に、運動ニューロン分化プロトコル(月曜日)に従って、化学戦術および体積勾配を開始する(表2 および 表3)。 脳由来神経栄養因子(BDNF)の30ng/mL、グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)および毛様神経栄養因子(CNTF)、ヒトアグリン(0.01 μg/mL)、ラミン(20μg/mL)を持つ運動ニューロン基底培地の200 μL/wellを追加します。運動ニューロンの基礎媒体(100 μL/well)を運動ニューロンコンパートメントに成長因子なしで加えます。 運動ニューロン分化の28日目まで、2日ごとにステップ7.2を繰り返します。週末はメディアの変更は必要ありません。 図1:マイクロ流体デバイスにおけるモータユニットプロトコルの概略図 運動ニューロン分化プロトコル22のタイムラインに従って、0日目から28日目までの分化タイムラインおよび共培養の概要。iPSCからの運動ニューロン分化は0日目に開始され、次の10日15日に対して前述のように行われる。9日目には、装置を殺菌し、PLOラミニンでコーティングする。MAB は T75 フラスコで拡張するために解凍されます。10日目には、運動ニューロンNPCは、デバイスの1つのコンパートメント(ライトグレー)の両方のウェルとチャネルでメッキされ、運動ニューロンへの分化が1週間続きます。MABは17日目にウェルと反対コンパートメント(ダークグレー)のチャネルの両方にメッキされます。18日目に、MABsのミオチューブへの分化が始まります。21日目には、装置のマイクロ溝を通して運動ニューロン-神経突起分極性を促進するために、体積および化学戦術勾配が確立される。運動ニューロンコンパートメントは、成長因子(明るい緑色のコンパートメント)のない運動ニューロン基底培地の100 μL/wellを受け取り、筋管コンパートメントは30 ng/mLの成長因子(濃緑色コンパートメント)を有する運動ニューロン基底培地の200 μL/wellを受け取った(表2 および 表3)。培養は、28日目の分析までさらに7日間、体積および化学戦術勾配で継続される。明視野画像は、組み立てられたマイクロ流体デバイスで培養された0日目、11日目、18日目、28日目の細胞形態を示しています。スケールバー、100 μm。この図は、ストクルンド・ディットラウ、K.ら18から変更されています。セルのイラストは、スマートサーバー医療アート22から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 8. 固定とICC 注:すべてのステップは、ニューロンの培養の剥離を防ぐために慎重に行われるべきです。次の手順でチャネルから液体を取り除かないでください。 ヒュームフードまたはラミナーフローでの固定を行う:慎重に固定する前にDPBSでデバイス内のすべての井戸を慎重に洗浄します。DPBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して、積層流(100 μL/well)のRTで15〜20分間固定します。注意:PFAは有毒です:個人的な保護具とヒュームフードでハンドル。 デバイスの上部ウェルに100 μLを慎重に追加し、数秒間待って固定ソリューションがチャネルを流れるのに対し、100 μLを底ウェルに追加します。反対側で繰り返します。インキュベーション後、PFA溶液を取り出し、DPBSで3倍の5分間静かに洗います。200 μL/well DPBSに保管し、10cmのシャーレをパラフィルムで密封し、ICC実験まで4°Cで保管します。メモ:デバイスが保管中に乾燥していないことを確認してください。 透過性溶液(100 μL/ウェル)をDPBSで0.1%のトリトンX-100で、ICC手順の1日目にRTで20分間インキュベートします。パーメビライゼーション溶液を取り出し、0.1%トリトンX-100/DPBS溶液(100 μL/well)に5%の正常ロバ血清をRTで30分間添加します。 5%の正常ロバ血清溶液を取り出し、一次抗体(材料表)を含むデバイスを0.1%トリトンX-100/DPBS溶液で2%正常ロバ血清でインキュベートし、一晩4°Cでインキュベートします。 ボリューム グラデーションを実装します。マイクログルーブの片側に100 μL/ウェルの抗体溶液を、もう一方の側に150 μL/wellを加えます(デバイスあたり合計500 μL)。注:マイクロ溝の両側に異なる抗体を使用することが可能です。この場合、コンパートメント間の流体分離を維持するために、マイクロ溝全体の一次または二次抗体を持つ体積勾配を実装しないでください。マイクロ溝の中の神経突起は勾配なしでは染色されません。 翌日(ICC手順の2日目)、一次抗体を取り除き、0.1%トリトンX-100/DPBS溶液で5分間慎重に洗浄します。注意:簡単に取り外し可能な文化では、5分間の洗浄3倍を30分間1倍に交換できます。 二次抗体(材料表)は光に敏感であるように、これから暗闇の中で働く。2%正常ロバ血清中の2%正常ロバ血清中の細胞をRTで1時間1時間用に2%正常ロバ血清でインキュベートする。インキュベーション後、二次抗体を取り除き、DPBSで3倍の5分間洗浄します。 DPBS(100 μL/well)にDAPIで核DNAのラベルをRTで20分間ラベルし、続いて0.1%トリトンX-100/DPBS溶液で5分間の洗浄の3x-4xを続けます。0.1%トリトンX-100/DPBS溶液を全てのウェルから取り出し、培養液を数秒間乾燥させてから、各ウェルに蛍光実装媒体を1滴ずつ加えてシールします。メモ:取り付けメディアを設定できるように、デバイスを少なくとも24時間水平に保ちます。24時間後、装置は4°Cのスライドケースに貯えることができる。 反転顕微鏡を使用したZスタック内の画像。 NJSを画像化するには、40倍の目的を使用して、myotube抗体(材料表)でマークされたミオチューブを見つけ、Zスタック記録を実行して神経細胞およびミオチューブ組織イメージングを確実に行います。myotube が大きすぎて 1 つのフレームに収まらない場合に備えて、複数の画像を撮影します。 NMJ 定量の場合、各 z スタックを介してニューロンのシナプス前マーカーと AChR マーカーの間の共局在化の数を手動でカウントします。z スタック内に存在する myotube の数に対する共ローカライズの数を正規化します。 9. SEM用デバイスの固定と準備 注:液体を交換する場合は、細胞の崩壊を避けるために培養物をカバーするために、常に少量を保管してください。このプロトコルは、非常に有毒な物質を使用し、それは、全体のプロセス中に、個人的な保護具とヒュームフードで動作することが必要とされます。 固定および分解: 0.1 Mカコチル酸ナトリウムバッファー(pH 7.6)に新鮮な2.5%グルタルアルデヒド(GA)を準備し、0.2 μmフィルターでフィルターし、37°Cまで加熱します。注意:GAとカコチル酸ナトリウムは有毒です:個人的な保護具とヒュームフードでハンドル。 慎重にDPBSでデバイスを慎重に洗浄して、メディアとセルの破片を取り除き、RTで15分間GA溶液を接頭辞します。 スカルメスを使用して、鉗子でデバイスを安定させながら、SEMシートをデバイスの周囲に慎重に切断します。切断中にデバイスを取り外さないようにしてください。3 cmのペトリ皿に鉗子の助けを借りて装置およびSEMシートを動かし、容易な処理のための10cm皿の中に3cm皿を置く。 接頭辞の15分後に、鉗子を使用してSEMシートからデバイスを慎重に取り外します。デバイスを1つのコーナーで取り外し、反対側の角に向かって斜め方向にゆっくりと取り外します。セルがデバイスから切り離されるのを観察します。 3 cm皿のSEMシート全体をカバーするために追加のGAソリューションを追加し、RTでまたは4°Cで一晩で合計2時間の固定を継続します。注: セルで覆われたサーフェスを避けて、フォースを使用して、GA ソリューションの下の SEM シートを静かに押します。 SEM の標準プロトコルを続行します。簡単に言えば、オスミウム四酸化されたインキュベートに続いて、エタノールの段階的なシリーズで脱水が行われた。SEMシートをカバースリップホルダーに挿入して、重要なポイントを乾燥させ、カーボンステッカーやコーティング用のサポートスタブに取り付けます。走査型電子顕微鏡を使用して、加速電圧5kV、動作距離7mmで画像を作成します。 10. 生細胞カルシウムイメージングを用いたNMJ機能評価 デバイスの準備:BDNF、GDNF、およびCNTFの30 ng/mLを有する18日目の運動ニューロン基底媒体の200 μL/wellで筋管コンパートメントをリフレッシュし、運動ニューロン基底培地の200 μL/wellの運動ニューロン基底媒体を成長因子なしでリフレッシュします(表2 および 表3)。 Fluo-4色素溶媒で希釈したFluo-4色素を5μMの最終濃度でミオチューブコンパートメントに加え、37°C、5%CO2 で暗闇の中で25分間インキュベートします。装置がインキュベーションの下にある間、450 mMの最終的な濃度で成長因子なしで運動ニューロンの基底媒体の塩化カリウムを薄くする。注意:蛍光-4 AMはカルシウム結合時に蛍光の増加を示すカルシウム指標である。染料は光に敏感なので、これからは暗闇の中で働きます。 25分後、BDNF、GDNF、およびCNTFの30 ng/mLを有する200μL/well 18運動ニューロン基底媒体と、運動ニューロン基底培地の100 μL/wellの運動ニューロンコンパートメントで、化学戦術と体積勾配を再確立する成長因子なしで、筋管コンパートメントをリフレッシュします。 NMJをブロックするには、AChR競合アンタゴニストのツボクラリン塩酸塩五水和物の19 μMでミオチューブコンパートメント培地を補います。注意:Tubocurarine塩酸塩五水和物は有毒です:個人的な保護具とヒュームフードでハンドル。 37°C、5%CO2に調整されたインキュベーターを装備した反転共焦点顕微鏡で録音を行います。 10xの目的で、明視野チャネルを使用して、ミオチューブコンパートメント内のミオチューブを見つけます。488チャンネルのレーザーパワー、ゲイン、オフセットを、蛍光4の蛍光が個々のミオチューブをマークするレベルに調整します。注:代表的な結果は、ソフトウェアのA1設定のスクロールバーをレーザーパワー5%、ゲイン60(HV)、オフセット0に調整することで獲得されました。 1 s間隔で記録時間を1分に設定します。5〜10sがベースラインを有し、続いて直ちに塩化カリウム溶液で運動ニューロンを刺激する記録。 5-10秒後に、25 μLの塩化カリウム溶液を運動ニューロンコンパートメントの1ウェルにゆっくりと加え、最終的な濃度50mMに到達します。注:これは、チャネルを介して波を作成し、記録上のアーティファクトを引き起こすので、あまりにも速く塩化カリウム溶液を追加しないでください。 2分のポーズで2回運動ニューロン刺激を伴う筋管コンパートメントを記録し、続いて筋管コンパートメントの25μL塩化カリウム溶液を直接刺激して、運動ニューロン脱分極とは無関係に直接ミオチューブ活性を評価する。 定量化の場合は、各 myotube を記録ソフトウェアで手動で丸で囲み、1 分間の Fluo-4 蛍光強度を分析します。カルシウム流入の増加を決定するには、塩化カリウムによる刺激後のピーク値から平均ベースライン値(すなわち、塩化カリウム刺激前の最初の10sから平均)を差し引く。代表的な結果は、ソフトウェアの時間測定ツールを使用して取得されました。