Generatie van menselijke motorische eenheden met functionele neuromusculaire juncties in microfluïdische apparaten
1Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute,KU Leuven – University of Leuven, 2VIB Bio Imaging Core,KU Leuven – University of Leuven, 3Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology,KU Leuven – University of Leuven, 4Department of Neurology,University Hospitals Leuven
Summary
We beschrijven een methode om menselijke motorische eenheden te genereren in commercieel verkrijgbare microfluïdische apparaten door door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide motorneuronen te co-cultiveren met menselijke primaire mesoangioblast-afgeleide myotubes, wat resulteert in de vorming van functioneel actieve neuromusculaire juncties.
Abstract
Neuromusculaire juncties (NMJ’s) zijn gespecialiseerde synapsen tussen het axon van het onderste motorneuron en de spier die de betrokkenheid van spiercontractie vergemakkelijken. Bij motorneuronaandoeningen, zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS) en spinale musculaire atrofie (SMA), degenereren NMJ’s, wat resulteert in spieratrofie en progressieve verlamming. Het onderliggende mechanisme van NMJ-degeneratie is onbekend, grotendeels te wijten aan het ontbreken van vertaalbare onderzoeksmodellen. Deze studie had tot doel een veelzijdig en reproduceerbaar in vitro model te creëren van een menselijke motoreenheid met functionele NMJ’s. Daarom werden door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide motorneuronen en van menselijke primaire mesoangioblast (MAB) afgeleide myotubes gecoöpteerd in commercieel verkrijgbare microfluïdische apparaten. Het gebruik van vloeistofgeïsoleerde microcompartimenten zorgt voor het onderhoud van celspecifieke micro-omgevingen terwijl cel-tot-cel contact via microgrooves mogelijk is. Door het toepassen van een chemotactische en volumetrische gradiënt werd de groei van motorneuron-neurieten door de microgrooves die myotube-interactie bevorderden en de vorming van NMJ’s gestimuleerd. Deze NMJ’s werden immunocytochemisch geïdentificeerd door co-lokalisatie van motorneuron presynaptische marker synaptophysine (SYP) en postsynaptische acetylcholine receptor (AChR) marker α-bungarotoxine (Btx) op myotubes en morfologisch gekarakteriseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). De functionaliteit van de NMJ’s werd bevestigd door het meten van calciumresponsen in myotubes bij depolarisatie van de motorneuronen. De motorische eenheid die wordt gegenereerd met behulp van standaard microfluïdische apparaten en stamceltechnologie kan toekomstig onderzoek naar NMJ’s in gezondheid en ziekte ondersteunen.
Introduction
NMJ’s vergemakkelijken de communicatie tussen lagere spinale motorneuronen en skeletspiervezels door de afgifte van neurotransmitters1. Bij motorneuronaandoeningen zoals ALS en SMA degenereren de NMJ’s, wat een verstoring in de communicatie met de spieren veroorzaakt2,3,4,5,6,7. Dit resulteert in patiënten die geleidelijk hun spierfunctie verliezen, waardoor ze rolstoelgebonden zijn en uiteindelijk afhankelijk zijn van ademhalingslevensondersteuning als gevolg van progressieve atrofie van vitale spiergroepen zoals het diafragma. De exacte onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor dit diepgaande verlies van NMJ’s bij deze aandoeningen zijn onbekend. Er zijn veel studies gedaan naar transgene diermodellen, die ons enig inzicht hebben gegeven in de pathogenese van NMJ-degeneratie5,6,8,9,10,11. Om de pathologie volledig te begrijpen en de denervatie tegen te gaan, is het echter belangrijk om een menselijk systeem te hebben, dat volledige toegankelijkheid mogelijk maakt.
Hier beschrijft het protocol een relatief eenvoudige manier om menselijke NMJ’s te genereren door het co-cultiveren van hiPSC-afgeleide motorneuronen en menselijke primaire MAB-afgeleide myotubes met behulp van commercieel beschikbare microfluïdische apparaten. Het gebruik van microfluïdica om de soma’s en axonen van neuronen te polariseren en vloeibaar te isoleren is bekend sinds de eerste beschrijving van de ‘Campenot’-kamers12 in de late jaren 1970. Sindsdien zijn er meer microfluïdische ontwerpen gefabriceerd, inclusief commerciële opties. De apparaten die in dit protocol worden gebruikt, bevatten twee compartimenten en elk compartiment bestaat uit twee putten die verbonden zijn met een kanaal13. De twee compartimenten zijn gespiegeld en verbonden met verschillende microgrooves. Deze microgrooves hebben een grootte die de groei van neuriet vergemakkelijkt met behoud van vloeibare isolatie tussen de twee compartimenten door middel van een capillaire hydrostatische druk13,14. Met behulp van dit systeem is het mogelijk om motorneuronen in het ene compartiment en spiercellen in het andere te kweken, elk in hun specifieke kweekmedium, terwijl het nog steeds een fysieke verbinding mogelijk maakt door neurieten die door de microgrooves gaan en zich bezighouden met de spiercellen. Dit model biedt een volledig toegankelijk en aanpasbaar in vitro systeem van een menselijke motorische eenheid, dat kan worden gebruikt om vroege NMJ-pathologie te bestuderen bij ziekten zoals ALS en SMA.
Protocol
Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen, die hun monsters leverden voor iPSC-generatie en MAB-oogst. De procedure werd goedgekeurd door de medisch-ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Leuven (nr. S5732-ML11268) en door de belangrijkste ethische commissie van het Verenigd Koninkrijk in het kader van het StemBANCC-project. Alle reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel en moeten steriel worden gebruikt. Media moeten vóór gebruik worden verwarmd tot kamertemperatuur (RT), tenzij anders aangegeven. Voor een overzicht van het co-cultuurprotocol, zie figuur 1. 1. Differentiatie van motorneuronenvoorlopers van iPSC’s Volg het motorneurondifferentiatieprotocol15, aangepast van een eerdere studie16, totdat de toestand van de neurale voorloper (NPC’s) van dag 10 is bereikt. Volgens het tijdsbestek van het protocol wordt de differentiatie gestart op een maandag (dag 0), wat resulteert in dag 10 NPC’s op een donderdag. Cryopreserve dag 10 NPC’s in knock-out serumvervanging met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) bij een dichtheid van 2 x 106- 4 x 106 cellen per injectieflacon.LET OP: DMSO is giftig: handvat in een zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen.OPMERKING: Ongeveer 50% van de dag 10 NPC’s zullen naar verwachting van vitaal belang zijn bij het ontdooien. Stop het motorneurondifferentiatieprotocol bij deze ‘dag 10 NPC’-toestand en cryopreserveer de NPC’s om een groot aantal NPC’s te genereren, die later kunnen worden opgeslagen en gebruikt, waardoor de lengte van de totale tijdlijn van het co-cultuurprotocol wordt teruggebracht van 28 dagen naar 19 dagen totaal. 2. Afleiding en onderhoud van menselijke MABs OPMERKING: MABs zijn vaat-geassocieerde mesenchymale stamcellen, die in dit geval zijn geoogst uit biopsieën verkregen van een 58-jarige gezonde donor. Alternatieve commerciële bronnen zijn beschikbaar. Het protocol om MABs te verkrijgen wordt kort uitgelegd. Raadpleeg voor meer informatie het gedetailleerde protocol17. Alle MAB-media moeten vóór gebruik worden verwarmd tot 37 °C. Hak het biopsieweefsel fijn en incubeer op collageen (van kalfsleer) gecoate 6 cm schaaltjes in een groeimedium (tabel 1) gedurende 2 weken. Vervang het medium om de 4 dagen. Om collageencoating te bereiden, lost u 100 mg collageen op in 20 ml azijnzuur van 0,1 m. Collageen heeft tijd nodig om op te lossen, dus plaats het mengsel ‘s nachts op een schommelplatform bij RT. Vul de volgende dag aan met 80 ml ddH2O tot een eindvolume van 100 ml.LET OP: Azijnzuur is giftig; handvat in een zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen.OPMERKING: Collageen uit kalfsleercoating kan tot 5x worden hergebruikt. Bewaren bij 4 °C. Bestrijk het hele oppervlak van de schaal of de kolf met collageen, sluit en incubeer gedurende 20 minuten bij RT in een laminaire stroom. Herstel na 20 minuten het collageen in een verse container, sluit de lege schaal / kolf en laat 10 minuten bij RT in de laminaire stroom. Breng de schaal/kolf over in de couveuse voor incubatie (37 °C, 5% CO2) gedurende een nacht (of ten minste 6 uur). Was 5x met Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium of magnesium (DPBS) voordat de cellen worden platgelegd. Na 14 dagen sorteert FACS (fluorescent activated cell sorting) de MABs voor menselijk alkalisch fosfatase17 gevolgd door verdere expansie. Bewaar de MABs op met collageen beklede T75-kolven in het groeimedium en vervang het groeimedium om de 2 dagen (10 ml per kolf). Cryopreserve, passage of zaad-MABs in apparaten bij het bereiken van 70% confluentie.OPMERKING: MABs verliezen hun myogene potentieel als gevolg van spontane fusies bij cel-tot-cel contact. Zorg ervoor dat u niet meer dan 70% samenvloeiing overschrijdt bij het uitbreiden van MABs. Eén 70% confluent T75-kolf bevat ongeveer 600.000-800.000 cellen, die kunnen worden gecryopreserveerd bij 100.000 cellen per injectieflacon. Elke injectieflacon kan later worden ontdooid en gezaaid in een T75-kolf voor uitbreiding. Om MABs te passeren, wast u ze eenmaal voorzichtig met 7 ml DPBS en incubeert u vervolgens gedurende 3 minuten in 7 ml MAB-dissociatieoplossing bij 37 °C in 5% CO2 om de cellen te dissociëren. Neutraliseer de MAB-dissociatieoplossing met 7 ml van het groeimedium, schraap de cellen voorzichtig en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 50 ml. Was de kolf voorzichtig met een extra 5 ml van het groeimedium om mogelijk resterende MABs te verzamelen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 300 x g en ga vervolgens rechtstreeks naar een nieuwe met collageen beklede T75-kolf voor expansie, cryopreserve in knock-out serumvervanging met 10% DMSO of tel om te zaaien in een microfluïdisch apparaat.OPMERKING: Passages worden 1x-2x per week uitgevoerd voor celuitbreiding tot een maximaal passagegetal van 13. Bij dissociatie lijken MABs bolvormig en groot van vorm wanneer ze onder de microscoop worden onderzocht. 3. Voorbereiding van voorgemonteerde microfluïdische apparaten – Dag 9 OPMERKING: Het protocol is aangepast van het neuronapparaatprotocol van de fabrikant van het microfluïdische apparaat en is aangepast voor het gebruik van zowel voorgemonteerde als siliconenapparaten. Hier worden voorgemonteerde apparaten gebruikt voor immunocytochemie (ICC) en calciumtransiënte opnames van levende cellen, terwijl siliconenapparaten worden gebruikt voor SEM. De tijdlijn van het protocol volgt de tijdlijn voor het motorneurondifferentiatieprotocol. Bereid de microfluïdische apparaten de dag voor het zaaien van cellen voor, omdat de coating ‘s nachts moet incuberen. Volgens het motorneuronenprotocol zal dit een woensdag zijn. Voeg ~10 ml 70%-100% ethanol toe aan een petrischaaltje van 10 cm. Gebruik een tang om het apparaat van de zeecontainer naar de petrischaal over te brengen voor sterilisatie. Dompel het apparaat gedurende 10 s onder in ethanol en breng het apparaat met een tang over op een stuk papier om gedurende ~ 30 minuten aan de lucht te drogen in de laminaire stroom. Draai het apparaat een paar keer om beide zijden te laten drogen. Wanneer het apparaat droog is, gebruikt u een tang om elk apparaat naar een individuele petrischaal van 10 cm te verplaatsen voor eenvoudige bedieningLET OP: Ethanol is giftig; handvat in een zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen Bestrijk het apparaat met Poly-L-ornithine (PLO) (100 μg/ml) in DPBS en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3 uur. Gebruik een P200-pipet om 100 μL PLO in DPBS toe te voegen in een bovenput zo dicht mogelijk bij de kanaalopening en observeer de vloeistof die van de bovenste put door het kanaal naar de onderste put gaat. Voeg vervolgens 100 μL PLO in DPBS toe aan de onderste put. Herhaal dit aan de andere kant van de microgrooves en eindig door 100 μL aan één kant van het apparaat toe te voegen om een volumegradiënt te creëren tussen de twee gespiegelde zijden van het apparaat om de microgrooves te coaten (bijv. rechterkant 200 μL, linkerkant 300 μL). Was het apparaat na 3 uur 3x gedurende 5 minuten met DPBS. Gebruik indien nodig een afzuigsysteem.OPMERKING: Zorg ervoor dat u op elk moment tijdens het coaten of kweken van de cellen luchtbelvorming in de kanalen vermijdt. Zelfs kleine belletjes zullen zich in korte tijd uitbreiden, waardoor coating, celzaaien of mediastroom over het kanaal worden geremd. Als de vloeistof tijdens het coaten in het kanaal stopt, voert u de PLO-oplossing van beide zijden rechtstreeks in het kanaal. Als er nog steeds bellen aanwezig zijn, gebruik dan 200 μL DPBS om het kanaal door te spoelen en herhaal het coatingproces zoals hierboven vermeld in stappen 3.3.1-3.3.2. Als er bubbels verschijnen na het zaaien van cellen, is het onmogelijk om het apparaat te herstellen, omdat het spoelen van het kanaal de cellen zal beschadigen. Bestrijk het apparaat met laminine (20 μg/ml) in een neurobasaal medium en incubeer gedurende de nacht bij 37 °C, 5% CO2. Volg dezelfde instructies voor PLO-coating in stap 3.3.1-3.3.2. Gebruik de volgende dag een P200-pipet en plaats de punt in de put tegenover de kanaalopening om de lamininecoating uit de putten te verwijderen. Voeg DPBS toe aan alle putten en laat de apparaten met DPBS in de laminaire stroom bij RT voor celzaaien.OPMERKING: Vanaf dit punt is het belangrijk om vloeistof (lamininecoating, DPBS, media, fixatieoplossing, enz.) niet rechtstreeks uit de kanalen te verwijderen, omdat dit luchtbelvorming kan veroorzaken. Inspecteer de apparaten altijd onder de microscoop voordat u cellen zaait. 4. Voorbereiding van siliconen microfluïdische apparaten – Dag 9 Bereid de siliconen microfluïdische apparaten de dag voor het zaaien van cellen, omdat de coating ‘s nachts moet incuberen. Volgens het motorneuronenprotocol zal dit een woensdag zijn. Voeg ~10 ml 70%-100% ethanol toe aan een petrischaaltje van 10 cm. Gebruik een tang om het apparaat van de zeecontainer naar de petrischaal te brengen voor sterilisatie. Dompel het apparaat gedurende 10 s onder in ethanol en breng het met een tang over naar een put in een plaat met 6 putten om gedurende ~ 30 minuten aan de lucht te drogen in de laminaire stroom. Plaats het apparaat op zijn kant om alle zijden te laten drogen. Snijd de SEM-vellen af tot de grootte van het apparaat (laat een paar mm aan elke kant). Herhaal de sterilisatie zoals hierboven vermeld in stap 4.1.1. Breng vervolgens met een tang over in een petrischaaltje van 10 cm om te drogen. Twee-drie SEM-vellen passen in één gerecht. Bestrijk de apparaten en de SEM-vellen met PLO (100 μg/ml) in DPBS en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3 uur. Voeg 1 ml PLO in DPBS per put toe aan elk apparaat in de 6-putplaat. Zorg ervoor dat het apparaat bovenop de PLO-oplossing zweeft met de kanaal- en microgroovezijde naar beneden in de vloeistof gericht. Voeg 10 ml PLO toe in DPBS per petrischaaltje van 10 cm en gebruik een tang om de SEM-vellen in de vloeistof te duwen.OPMERKING: SEM-vellen drijven meestal bovenop de coatingoplossing. Voordat u het apparaat en de plaat monteert, draait u het SEM-vel zodat het oppervlak, dat in contact is geweest met de PLO, contact maakt met het kanaal en het microgroove-oppervlak van het apparaat. Was het apparaat en de SEM-vellen na 3 uur 2x gedurende 5 minuten met DPBS, gevolgd door nog een wasbeurt gedurende 5 minuten met steriel water. Gebruik indien nodig een afzuigsysteem. Breng elk SEM-vel over in een individuele petrischaal van 10 cm voor eenvoudige bediening.OPMERKING: Zowel apparaten als SEM-vellen moeten volledig droog zijn voordat ze worden gemonteerd. De laatste wasbeurt met steriel water verwijdert potentiële zoutkristallen uit de DPBS, die anders de assemblage zouden kunnen remmen. Werk onder een microscoop in een laminaire stroom. Gebruik een tang om het siliconenapparaat met het kanaal en de microgroove met de zijkant naar beneden in een hoek van 90° op het SEM-vel te monteren, zodat alle zijden zijn uitgelijnd. Druk lichtjes op het apparaat om ervoor te zorgen dat u niet alleen de buitenranden afdicht, maar ook rond putten, kanalen en microgrooves.OPMERKING: Gebonden gebieden zien er grijs uit, terwijl de gebieden die nog niet zijn gemonteerd, duidelijk onder de microscoop verschijnen. Zorg ervoor dat alle gebieden goed zijn afgesloten zonder luchtbellen om loslating van het apparaat tijdens het kweken te voorkomen. In het geval van vuil of zoutkristallen die de montage blokkeren, moet u zowel sem-plaat als -apparaat opnieuw wassen in steriel water en drogen voordat u de montageprocedure opnieuw probeert. Als de microgrooves vervormd lijken door te hard op het apparaat te drukken, verwijdert u het apparaat volledig uit het SEM-blad en probeert u de montage opnieuw uit te voeren. Wees voorzichtig bij het coaten en vervangen van media zodra het apparaat is gemonteerd. Werk onder een microscoop in een laminaire stroom. Bestrijk het apparaat met laminine (20 μg/ml) in een neurobasaal medium en incubeer gedurende de nacht bij 37 °C, 5% CO2.OPMERKING: Nachtelijke incubatie verhardt het siliconenapparaat en sluit het verder af op het SEM-vel. Gebruik een P200-pipet om 100 μL van de laminine-oplossing toe te voegen in een bovenput zo dicht mogelijk bij de kanaalopening en observeer de vloeistof die van de bovenkant goed door het kanaal naar de bodem goed gaat. Controleer op lekkage rond de put en het kanaal. Voeg vervolgens 100 μL laminine-oplossing toe aan de bodemput en controleer op lekkage. Herhaal dit aan de andere kant van de microgrooves en werk af met een extra 100 μL aan de ene kant van het apparaat om een volumegradiënt te creëren tussen de twee gespiegelde zijden van het apparaat om de microgrooves te coaten (bijv. rechterkant 200 μL, linkerkant 300 μL).OPMERKING: Verwijder in geval van lekkage de lamininecoating, demonteer het apparaat en de SEM-vellen en was beide in steriel water. Laat ze drogen en herhaal vanaf stap 4.3. Verwijder de volgende dag de coating van de putten met een P200-pipet door de punt in de put tegenover de kanaalopening te plaatsen. Voeg DPBS toe aan alle putten en laat de apparaten met DPBS in de laminaire stroom bij RT voor celzaaien.OPMERKING: Verwijder vanaf dit punt geen vloeistof (lamininecoating, DPBS, media, fixatieoplossing, enz.) rechtstreeks uit de kanalen, omdat dit luchtbelvorming kan veroorzaken. Inspecteer de apparaten altijd onder de microscoop voordat u cellen zaait. 5. Plating van NPC’s in microfluïdische apparaten – Dag 10 OPMERKING: Volgens het motorneurondifferentiatieprotocol15 vindt plating van dag 10 NPC’s plaats op een donderdag. Gebruik vers gedissocieerde dag 10 NPC’s15, of ontdooi 1-2 injectieflacons met gebankte NPC’s per 10 ml motorneuronmedium van dag 10 (tabel 2 en tabel 3) met ROCK-remmer (10 μL / ml) oplossing en centrifugeer de celsuspensie bij 100 x g gedurende 4 minuten. Resuspend de celkorrel in 500-1000 μL van dag 10 motorneuronmedium met ROCK-remmer (10 μL / ml) oplossing en tel de levende cellen met behulp van een voorkeurstelmethode.OPMERKING: Zoals hieronder vermeld, moet u ervoor zorgen dat u de NPC’s opnieuw opschordt in de juiste hoeveelheid media om een optimaal zaaivolume te accommoderen. Verwijder DPBS uit twee putjes aan één kant van de microgrooves in het apparaat met een P200-pipet en zaad 250.000 NPC’s per apparaat in 60-100 μL van dag 10 motorneuronmedia. Zaai in de put rechtsboven 30-50 μL van de celsuspensie (125.000 cellen) dicht bij de kanaalopening in een hoek van 45° en sleep de resterende vloeistof voorzichtig langs de putvloer naar het midden van de put met de pipetpunt. Pauzeer een paar seconden om de celsuspensie door het kanaal te laten stromen voordat u dit herhaalt in de onderste put (125.000 cellen in 30-50 μL). Gebruik een pen om de gezaaide kant “NPC” of gelijkwaardig te markeren voor eenvoudige oriëntatie van het apparaat zonder microscoop. Incubeer het apparaat bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 5 minuten om celaanhechting mogelijk te maken voordat u de tweepittenputten bijvult met een extra dag 10 motorneuronmedium (totaal 200 μL / put) en incubateer opnieuw bij 37 °C, 5% CO2.OPMERKING: Elke put kan 200 μL bevatten. Het zaaien van cellen in zowel putten als kanalen zorgt voor een robuuste structuur van de cultuur, waardoor het risico op celloslating tijdens mediaveranderingen wordt verlaagd. Het is mogelijk om minder cellen in alleen het kanaal te zaaien. Dit maakt de cultuur echter gevoeliger voor de volumestroom door de kanalen tijdens elke mediumverandering. Gebruik een P200-pipet om DPBS uit de twee putten aan de andere kant van de microgrooves tegenover de vers gezaaide NPC’s te verwijderen. Voeg 200 μL /put van dag 10 motorneuronmedia toe en wacht een paar seconden tussen de boven- en onderput om media door het kanaal te laten stromen. Voeg vervolgens 6 ml DPBS per schotel van 10 cm rond het apparaat toe om verdamping van het medium tijdens de incubatie te voorkomen.OPMERKING: Voeg indien nodig extra DPBS toe aan het apparaat tijdens de kweekperiode. Voer een volledige motorneuronmediumverandering uit in beide compartimenten van het apparaat op dag 11 (vrijdag), dag 14 (maandag) en dag 16 (woensdag) (tabel 2 en tabel 3). Voeg verse mediasupplementen toe op de dag van de mediumverandering.OPMERKING: Voer vanaf dit punt alle medium wijzigingen uit met een P200 pipet. Plaats de pipetpunt altijd uit de buurt van het kanaal aan de rand van de put en verwijder geen vloeistof rechtstreeks uit het kanaal. Zorg ervoor dat u de siliconen apparaten niet losmaakt. Het verwijderen en toevoegen van medium moet langzaam gebeuren om celloslating te voorkomen. Verwijder voorzichtig alle media in beide putten met NPC’s door de P200-pipetpunt aan de onderkant van de putwand tegenover de kanaalopening te plaatsen. Voeg langzaam 50-100 μL vers motorneuronmedium toe aan de bovenste put door de P200-pipetpunt aan de bovenrand van de putwand tegenover de kanaalopening te plaatsen. Pauzeer een paar seconden om het medium door het kanaal te laten stromen voordat u 50-100 μL motorneuronmedium aan de bodemput toevoegt. Herhaal dit proces zorgvuldig totdat beide putten 200 μL/put bevatten. Herhaal dit aan de zijkant zonder cellen. 6. Plating van MAB in microfluïdische apparaten – Dag 17 Ongeveer 7 dagen voor het zaaien van MABs in de microfluïdische apparaten (dag 10 van motorneurondifferentiatie), ontdooi MABs en zaai ze in het groeimedium (tabel 1) in een T75-kolf bedekt met collageen om voldoende celuitbreiding mogelijk te maken. Zie rubriek 2. Dissociseer op dag 17 van de differentiatie van motorneuronen (donderdag) MABs zoals uitgelegd in stap 2.4, resuspend de celkorrel in ~ 500 μL groeimedium en tel de levende cellen met behulp van een voorkeurstelmethode.OPMERKING: Zoals hieronder vermeld, moet u ervoor zorgen dat u de MABs opnieuw opschordt in de juiste hoeveelheid media om het optimale zaaivolume mogelijk te maken. Verwijder het motorneuronmedium aan de ongeleide kant van de microgrooves in het apparaat met een P200-pipet, was voorzichtig met DPBS en zaad 200.000 MABs per apparaat in 60-100 μL groeimedium. Zaai in de put rechtsboven 30-50 μL celsuspensie (100.000 cellen) dicht bij de kanaalopening in een hoek van 45° en sleep de resterende vloeistof voorzichtig langs de putvloer naar het midden van de put met de pipetpunt. Pauzeer een paar seconden om de stroom van cellen door het kanaal te laten voordat u het herhaalt in de onderste put (100.000 cellen in 30-50 μL). Incubeer het apparaat bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 5 minuten om celaanhechting mogelijk te maken voordat u de twee vers MAB-gezaaide putten bijvult met extra groeimedium (totaal 200 μL / put). Opnieuw incuberen bij 37 °C, 5% CO2.OPMERKING: Er is geen gemiddelde verandering nodig op dag 17 aan de motorneuronzijde van het apparaat. Dag 17 mediumverandering volgens de eerder gepubliceerde motorneurondifferentiatiemethode15 wordt in plaats daarvan uitgevoerd op dag 18 (vrijdag). 7. Implementatie van een volumetrische en chemotactische gradiënt om de groei van motorneuronneuronen naar het MAB-compartiment te bevorderen Voer op dag 18 een volledige mediumverandering uit aan de motorneuronzijde met dag 18 motorneuronmedium (200 μL/put). Volg de instructies voor middelgrote wijzigingen die worden vermeld in de stappen 5.5.1-5.5.2. Start de MAB-differentiatie in het MAB-compartiment van het hulpmiddel (tabel 2 en tabel 4). Was de MAB-compartimenten eenmaal zorgvuldig met DPBS voordat u het voorverwarmde MAB-differentiatiemedium (tabel 4) toevoegt, aangevuld met 0,01 μg/ml human agrin (200 μL/putje).OPMERKING: MABs zullen fuseren en multinucleated myotubes vormen in de loop van een week. Op dag 21, volgens het motorneurondifferentiatieprotocol (maandag), start de chemotactische en volumetrische gradiënt (tabel 2 en tabel 3). Voeg 200 μL/putje motorneuron basaal medium met 30 ng/ml hersen-afgeleide neurotrofe factor (BDNF), gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) en ciliaire neurotrofe factor (CNTF), humane agrin (0,01 μg/ml) en laminine (20 μg/ml) toe aan het myobuiscompartiment (voorheen gedefinieerd als het MAB-compartiment). Voeg motorneuron basaal medium (100 μL/put) zonder groeifactoren toe aan het motorneuroncompartiment. Herhaal stap 7.2 elke tweede dag tot dag 28 van de differentiatie van motorneuronen. In het weekend is geen mediawissel nodig. Figuur 1: Schematisch overzicht van het motoreenheidsprotocol in microfluïdische apparaten. Differentiatietijdlijn en co-cultuuroverzicht van dag 0 tot dag 28 volgens de tijdlijn van het motorneurondifferentiatieprotocol22. Motorneurondifferentiatie van iPSC’s wordt gestart op dag 0 en uitgevoerd zoals eerder vermeld gedurende de volgende 10 dagen15. Op dag 9 wordt het apparaat gesteriliseerd en gecoat met PLO-laminine. MABs worden ontdooid voor uitbreiding in T75-kolven. Op dag 10 worden de motorneuron-NPC’s in beide putten en het kanaal van één compartiment (lichtgrijs) van het apparaat geplateerd, waar hun differentiatie in motorneuronen een week lang wordt voortgezet. MABs worden op dag 17 in beide putten en het kanaal van het tegenoverliggende compartiment (donkergrijs) verguld. Op dag 18 wordt begonnen met MABs differentiatie in myotubes. Op dag 21 wordt een volumetrische en chemotactische gradiënt vastgesteld om de polarisatie van motorneuronen en neurieten door de microgrooves van het apparaat te bevorderen. Het motorneuroncompartiment ontving 100 μL/put basaal medium motorneuron zonder groeifactoren (lichtgroen compartiment), terwijl het myotubecompartiment 200 μL/put basaal medium motorneuron ontving met 30 ng/ml groeifactoren (donkergroen compartiment) (tabel 2 en tabel 3). De kweek wordt voortgezet met de volumetrische en chemotactische gradiënt gedurende nog eens 7 dagen tot de analyse op dag 28. Bright-field beelden tonen celmorfologie op dag 0, dag 11, dag 18 en dag 28 gekweekt in voorgemonteerde microfluïdische apparaten. Schaalbalk, 100 μm. Dit cijfer is aangepast van Stoklund Dittlau, K. et al.18. Celillustraties zijn aangepast van Smart Server medical Art22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 8. Fixatie en ICC OPMERKING: Alle stappen moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om loslating van de neuronale culturen te voorkomen. Verwijder geen vloeistof uit de kanalen tijdens de volgende stappen. Voer fixatie uit in een zuurkast of laminaire stroming: was alle putten in het apparaat zorgvuldig eenmaal met DPBS voordat u ze fixeert. Fixeren met 4 % paraformaldehyde (PFA) in DPBS gedurende 15-20 min bij RT in de laminaire stroom (100 μL/put).LET OP: PFA is giftig: hanteer in een zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen. Voeg voorzichtig 100 μL toe aan de bovenste put van het apparaat en wacht een paar seconden om de fixatieoplossing door het kanaal te laten stromen voordat u 100 μL aan de onderste put toevoegt. Herhaal dit aan de andere kant. Verwijder na de incubatie de PFA-oplossing en was voorzichtig 3x gedurende 5 minuten met DPBS. Laat DPBS in 200 μL/putje voor opslag en sluit de 10 cm petrischaal af met parafilm om bij 4 °C te bewaren tot icc experiment.OPMERKING: Zorg ervoor dat de apparaten niet uitdrogen tijdens het bewaren. Incubeer de cellen met een permeabilisatieoplossing (100 μL/put) van 0,1% Triton X-100 in DPBS gedurende 20 minuten bij RT op dag 1 van de ICC-procedure. Verwijder de permeabilisatieoplossing en voeg 5% normaal ezelserum toe in 0,1% Triton X-100/DPBS-oplossing (100 μL/put) gedurende 30 minuten bij RT. Verwijder de 5% normale ezelserumoplossing en incubeer apparaten met primaire antilichamen (Materiaaltabel) in 2% normaal ezelserum in 0,1% Triton X-100/DPBS-oplossing en incubeer bij 4 °C gedurende de nacht. Implementeer een volumegradiënt. Voeg 100 μL/putje antilichaamoplossing toe aan de ene kant van de microgrooves en 150 μL/putje aan de andere kant (500 μL totaal per apparaat).OPMERKING: Het is mogelijk om verschillende antilichamen aan weerszijden van de microgrooves te gebruiken. Implementeer in dit geval geen volumegradiënt met primaire of secundaire antilichamen over microgrooves om de vloeistofisolatie tussen compartimenten te ondersteunen. De neurieten in de microgrooves zullen niet worden gekleurd zonder de gradiënt. Verwijder de volgende dag (dag 2 van de ICC-procedure) de primaire antilichamen en was het apparaat voorzichtig 3x gedurende 5 minuten met 0,1% Triton X-100/DPBS-oplossing.OPMERKING: In gemakkelijk afneembare culturen kan het wassen van 3x gedurende 5 minuten worden vervangen door 1x gedurende 30 minuten. Werk voortaan in het donker, want secundaire antistoffen (Tabel der Materialen) zijn lichtgevoelig. Incubeer cellen met secundaire antilichamen in 2% normaal ezelserum in 0,1% Triton X-100/DPBS-oplossing gedurende 1 uur bij RT. Implementeer een volumegradiënt zoals vermeld in stap 8.3.1. Verwijder na incubatie de secundaire antilichamen en was 3x gedurende 5 minuten met DPBS. Label het nucleaire DNA met DAPI in DPBS (100 μL/putje) gedurende 20 minuten bij RT gevolgd door 3x-4x 5 min wassen met 0,1% Triton X-100/DPBS oplossing. Verwijder de 0,1% Triton X-100/DPBS-oplossing uit alle putten en laat de cultuur enkele seconden drogen voordat u een druppel fluorescentiemontagemedia in elke put toevoegt om af te dichten.OPMERKING: Houd de apparaten ten minste 24 uur horizontaal zodat de montagemedia kunnen worden ingesteld. Na 24 uur kunnen de apparaten worden opgeborgen in een schuifkast bij 4 °C. Beeld in z-stacks met een omgekeerde microscoop. Om NMJ’s in beeld te brengen, gebruikt u een 40x-objectief om de myotubes te lokaliseren die zijn gemarkeerd met een myotube-antilichaam (Table of Materials) en voert u z-stack-opnames uit om neuronale en myotube-weefselbeeldvorming te garanderen. Maak meerdere foto’s voor het geval de myotube te groot is om in één frame te passen. Tel voor NMJ-kwantificering handmatig het aantal co-lokalisaties tussen een neuronale presynaptische marker en een AChR-marker door elke z-stack. Normaliseer het aantal co-lokalisaties naar het aantal myotubes in de z-stack. 9. Fixatie en voorbereiding van het hulpmiddel voor SEM OPMERKING: Houd bij het verwisselen van vloeistoffen altijd een kleine hoeveelheid aan om de cultuur te bedekken om te voorkomen dat de cel instort. Dit protocol maakt gebruik van zeer giftige stoffen en het is verplicht om tijdens het hele proces met persoonlijke beschermingsmiddelen en in een zuurkast te werken. Fixatie en demontage: Bereid verse 2,5% glutaaraldehyde (GA) in 0,1 M natriumcacellodaatbuffer (pH 7,6), filter met een filter van 0,2 μm en verwarm tot 37 °C.LET OP: GA en natriumcacodylaat zijn giftig: handvat in een zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen. Was het apparaat eenmaal voorzichtig met DPBS om de media en het celafval te verwijderen en vervolgens het voorvoegsel met GA-oplossing gedurende 15 minuten bij RT. Gebruik een scalpel om het SEM-vel voorzichtig tot aan de omtrek van het apparaat te snijden terwijl u het apparaat met een tang vastzet. Zorg ervoor dat u het apparaat niet losmaakt tijdens het snijden. Verplaats het apparaat en sem-vel met behulp van een tang naar een petrischaaltje van 3 cm en plaats de schaal van 3 cm in een schaal van 10 cm voor eenvoudige bediening. Verwijder na 15 minuten voorvoegsel het apparaat voorzichtig van het SEM-vel met een tang. Maak het apparaat in een hoek los en verwijder het langzaam in een diagonale richting naar de andere hoek. Observeer hoe de cellen loskomen van het apparaat. Voeg een extra GA-oplossing toe om het hele SEM-vel in de schaal van 3 cm te bedekken en ga door met fixeren gedurende in totaal 2 uur bij RT of ‘s nachts bij 4 °C.OPMERKING: Duw het SEM-vel voorzichtig onder de GA-oplossing met een tang door met cellen bedekte oppervlakken te vermijden. Ga verder met een standaardprotocol voor SEM. Kortom, incuberen in osmiumtetroxide gevolgd door uitdroging met een gesorteerde reeks ethanol. Plaats SEM-vel in een hoesliphouder voor het drogen van kritieke punten en monteer op steunstompen voor koolstofstickers en coating. Gebruik een scanning elektronenmicroscoop om te fotograferen met een versnellende spanning van 5 kV en een werkafstand van 7 mm. 10. Beoordeling van NMJ-functionaliteit met behulp van live-cell calcium imaging Apparaten voorbereiden: Ververs het myotubecompartiment met 200 μL/put van dag 18 motorneuron basaal medium met 30 ng/ml BDNF, GDNF en CNTF en het motorneuroncompartiment met 200 μL/put van motorneuron basaal medium zonder groeifactoren (tabel 2 en tabel 3). Voeg Fluo-4 AM-kleurstof verdund in Fluo-4 kleurstofoplosmiddel toe aan het myotubecompartiment met een eindconcentratie van 5 μM en incubeer het apparaat in het donker bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 25 minuten. Terwijl het apparaat onder incubatie is, verdunt kaliumchloride in basaal medium van motorneuronen zonder groeifactoren tot een eindconcentratie van 450 mM.OPMERKING: Fluo-4 AM is een calciumindicator, die een toename van fluorescentie vertoont bij calciumbinding. Werk vanaf nu in het donker, want de kleurstof is lichtgevoelig. Ververs na 25 minuten het myotube-compartiment met 200 μL / put van dag 18 motorneuron basaal medium met 30 ng / ml BDNF, GDNF en CNTF en het motorneuroncompartiment met 100 μL / put van motorneuron basaal medium zonder groeifactoren om de chemotactische en volumetrische gradiënt te herstellen. Om de NMJ’s te blokkeren, vult u het myotube-compartimentmedium aan met 19 μM van de AChR-competitieve antagonist tubocurarinehydrochloride pentahydraat.LET OP: Tubocurarinehydrochloride pentahydraat is giftig: hanteer in een zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen. Voer opnames uit met een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een incubator aangepast op 37 °C, 5% CO2. Gebruik bij een 10x objectief het heldere veldkanaal om de myotubes in het myotube-compartiment te lokaliseren. Pas het laservermogen, de versterking en de offset voor het 488-kanaal aan tot een niveau waarop de Fluo-4-fluorescentie de individuele myobuizen markeert.OPMERKING: Representatieve resultaten werden verkregen door de schuifbalken in de A1-instellingen van de software aan te passen op een laservermogen van 5%, een winst van 60 (HV) en een offset van 0. Stel de opnametijd in op 1 min met intervallen van 1 s. Record voor 5-10 s om een baseline te hebben, gevolgd door het onmiddellijk stimuleren van motorneuronen met de kaliumchloride-oplossing. Voeg na 5-10 s in de opname langzaam 25 μL kaliumchlorideoplossing toe aan een put van het motorneuroncompartiment om een uiteindelijke concentratie van 50 mM te bereiken.OPMERKING: Vermijd het toevoegen van de kaliumchloride-oplossing te snel, omdat dit een golf door het kanaal zal veroorzaken, waardoor artefacten op de opname ontstaan. Noteer het myotubecompartiment tweemaal met motorneuronstimulatie met een pauze van 2 minuten, gevolgd door directe stimulatie met 25 μL kaliumchlorideoplossing van het myotubecompartiment om de directe myotube-activiteit onafhankelijk van depolarisatie van motorneuronen te beoordelen. Voor kwantificeringen omcirkelt u elke myotube handmatig met de opnamesoftware en analyseert u de fluorescerende intensiteit van Fluo-4 gedurende de periode van 1 minuut. Om de toename van de calciuminstroom te bepalen, trekt u de gemiddelde basiswaarde (d.w.z. gemiddeld van de eerste 10 s vóór kaliumchloridestimulatie) af van de piekwaarde na stimulatie met kaliumchloride. De representatieve resultaten werden verkregen met behulp van de tijdmetingstool van de software.
Representative Results
Generatie van NMJ’s in microfluïdische apparatenOm een menselijke motorische eenheid met functionele NMJ’s te genereren in commercieel verkrijgbare microfluïdische apparaten, werden menselijke iPSC-afgeleide motorneuronen en menselijke MAB-afgeleide myotubes gebruikt. De kwaliteit van het uitgangscelmateriaal is belangrijk, en vooral het fusievermogen van de MABs tot myotubes is cruciaal voor een succesvolle uitkomst van dit protocol. MABs zijn gemakkelijk te houden in cultuur. Het is echter belangrijk om het fusievermogen van elke batch te beoordelen voordat u ze op de microfluïdische apparaten toepast (aanvullende figuur 1A,B)18. Batches die na 10 dagen differentiatie geen myotube-vorming vertonen, mogen niet worden gebruikt. De fusie-index in supplementele figuur 1B werd bepaald door het percentage kernen binnen myotubes te berekenen dat positief is voor elke myotube-marker van het totale aantal kernen per afbeelding. We ontdekten dat een fusie-index van ongeveer 8% voldoende was voor onze co-cultuur bij het genereren van NMJ’s. Het is altijd belangrijk om een motorneurondifferentiatie te beginnen van een zuivere cultuur van iPSC’s. Hoe zuiverder de input – hoe zuiverder de uitkomst. Het motorneurondifferentiatieprotocol genereert motorneuronculturen, die doorgaans 85% -95% positief zijn voor motorneuronmarkers (aanvullende figuur 1C, D) 18. De resterende cellen zullen meestal ongedifferentieerde voorlopercellen zijn, die in sommige gevallen een uitgebreide proliferatie zullen ondergaan en hierbij een negatieve invloed hebben op de kwaliteit van de cultuur. Om het beste resultaat van dit protocol te krijgen, moet de efficiëntie van de differentiatie van motorneuronen worden geëvalueerd voordat de dag 10 motorneuron-NPC’s in het apparaat worden aangebracht. Daarnaast kan op dag 11 een NPC-kwaliteitscontrole worden uitgevoerd om de expressie van NPC-marker Olig2 te evalueren (aanvullende figuur 1E,F). Aanvankelijk werden de motorneuron-NPC’s en de MABs op dag 10 op hetzelfde tijdstip geplateerd. Hier werd op dag 11 de MAB-differentiatie geïnitieerd. De volume- en groeifactorgradiënt die op dag 14 werd geïmplementeerd, stelde ons in staat om de NMJ-formatie op dag 21 te evalueren, waardoor het protocol met een week werd verkort. Interessant is dat we karakteristieke NMJ-formatie door ICC konden waarnemen (aanvullende figuur 2A). We waren echter niet in staat om een functionele output te verkrijgen via de live-cell calciumopnamen zo vroeg in de differentiatie van motorneuronen (gegevens niet getoond). We concludeerden dat de motorneuronen nog niet volwassen genoeg waren om functionele NMJ-verbindingen met de myotubes te vormen, hoewel de NMJ-morfologie er veelbelovend uitzag. Dit is in lijn met onze eerdere observaties dat spontane actiepotentialen in motorneuronen, geregistreerd door patch-clamp elektrofysiologische analyse, pas optreden op dag 35 van motorneurondifferentiatie15. Daarnaast hebben we geprobeerd de rijping van motorneuronen en de duurzaamheid van de co-cultuur te verlengen door de motorneuronen in het apparaat gedurende 2 weken (dag 24) te laten rijpen, voordat de MABs worden platgelegd. Helaas werd een grote hoeveelheid spontane motorneuron-neuriet kruising door microgrooves waargenomen, wat resulteerde in de remming van MAB-hechting (aanvullende figuur 2B). Door het ontbreken van myotubevorming in het kanaal slaagden we er niet in om NMJ’s op dag 36 te identificeren en pasten daarom het 28-dagenprotocol toe (figuur 1). Identificatie, kwantificering en morfologische karakterisering van in vitro NMJ’sNa het volgen van het 28-dagenprotocol (figuur 1) konden volledig functionele NMJ’s worden verkregen. Zowel in vivo als in vitro worden NMJ’s immunohisto- of immunocytochemisch gekarakteriseerd door de co-lokalisatie van een presynaptische marker en een postsynaptische marker. In deze studie werd een combinatie van neurofilament heavy chain (NEFH) en SYP als presynaptische markercombinatie gebruikt, waardoor een enkel neuriet uit de soma van het motorneuron naar het meest distale proces kon worden gevolgd. Aan de spierzijde wordt Btx veel gebruikt als een postsynaptische marker voor AChRs en werd het ook gebruikt in deze studie. De suppletie van agrin en laminine bevordert de clustering van de AChRs bij het sarcolemma19,20,21, waardoor het gemakkelijker wordt om AChRs in vitro te identificeren en verhoogt ook het aantal aanwezige AChRs en NMJ’s18. Om de NMJ’s op een onbevooroordeelde manier te lokaliseren en te berekenen, wordt elke myotube geïdentificeerd door myosine heavy chain (MyHC)-positiviteit en afgebeeld in z-stacks bij 40x vergroting met behulp van een omgekeerde confocale microscoop. Gedurende zeer lange myotubes werden meerdere z-stacks verworven. Voor beeldanalyse wordt het aantal co-lokalisaties tussen NEFH/SYP en Btx handmatig geteld door elke z-stack, en het aantal co-lokalisaties wordt genormaliseerd naar het aantal myotubes in de z-stack (Figuur 2A-C)18. Niet alle myotubes zullen NMJ’s hebben, zoals te zien is in de kwantificering van geïnnerveerde myotubes (figuur 2D). Daarom is het belangrijk om een onbevooroordeelde opnamebenadering uit te voeren, waarbij alle myotubes worden afgebeeld, onafhankelijk van Btx-aanwezigheid. Het is mogelijk om twee soorten morfologieën te identificeren in dit in vitro systeem. De NMJ’s verschijnen ofwel als één contactpunt NMJ’s, waarbij een neuriet een cluster van AChRs op één interactiepunt raakt, of meerdere contactpunt NMJ’s, waar een neuriet uitwaaiert en over een groter oppervlak met het AChR-cluster in contact komt. Deze twee morfologieën kunnen zowel immunocytochemisch worden geïdentificeerd (figuur 2A)18 als met SEM (figuur 2B)18, en kunnen eveneens worden gekwantificeerd (figuur 2C)18. Over het algemeen vergemakkelijken de meerdere contactpunten een bredere verbinding door een grote spierinbedding, wat wijst op een meer volwassen NMJ-formatie. Daarentegen worden de NMJ’s met één contactpunt als minder volwassen beschouwd vanwege de vroege ontwikkelingstoestand van de cultuur. Functionele evaluatie van in vitro NMJ’sOm de functionaliteit van de NMJ’s te evalueren, werden live-cell calcium transiënte opnames gebruikt (figuur 3)18. Gebruikmakend van het vloeistofgeïsoleerde systeem van de microfluïdische apparaten, werd de motorneuron soma-zijde gestimuleerd met een hoge concentratie (50 mM) kaliumchloride, terwijl tegelijkertijd een instroom van calcium in de myotubes werd geregistreerd, die waren geladen met de calciumgevoelige Fluo-4-kleurstof (figuur 3A). Vrijwel onmiddellijk na activering van motorneuronen konden we een calciuminstroom in de myobuizen waarnemen door een karakteristieke golfvorming, die een functionele verbinding bevestigt via het motorneuron-neuriet en de myobuis (figuur 3A-C)18. Er werden geen spontane calciumgolven of spontane myotube-contracties waargenomen, hoewel myotube-contractie bij directe stimulatie met kaliumchloride werd waargenomen. De specificiteit van de verbinding werd verder bevestigd door de competitieve AChR-antagonist, tubocurarinehydrochloride pentahydraat (DTC) toe te voegen aan het myotubecompartiment (figuur 3A), wat resulteerde in een remming van de calciuminstroom (figuur 3C). Dit effect bevestigde dat de verbinding tussen motorneuronen en myotubes resulteerde in volledig functionele NMJ’s. Om het aantal actieve myotubes door NMJ-stimulatie te evalueren, werd het myotube-compartiment direct gestimuleerd met kaliumchloride om het totale aantal actieve myotubes in dit compartiment te identificeren. Ongeveer 70% van de myotubes was actief door motorneuron-gestimuleerde activering met kaliumchloride (figuur 3D)18. Deze resultaten bevestigen de optimale NMJ-vorming, aantal, morfologie en functionaliteit door co-culturing van de iPSC-afgeleide motorneuronen en MAB-afgeleide myotubes tijdens een 28-daags protocol. Figuur 2: NMJ-vorming in microfluïdische apparaten. (A) Confocale micrografieën van NMJ-formatie in voorgemonteerde microfluïdische apparaten op dag 28. NMJ’s worden geïdentificeerd door de co-lokalisatie (pijlpunten) van presynaptische markers (NEFH en SYP) en postsynaptische AChR-marker (Btx) op MyHC-gekleurde myotubes. NMJ’s worden morfologisch geïdentificeerd door middel van de vorming van één of meerdere contactpunten tussen neurieten en AChR-clusters. DAPI-labelkernen. Schaalbalk, 25 μm. Inzet toont een vergroting van een NMJ. Inzetschaalbalk, 10 μm. (B) SEM van NMJ-morfologie in siliconen microfluïdische apparaten op dag 28. Pijlpunten tonen de inbedding van neuriet in de myotube. Schaalbalk, 2 μm. Inzet toont een vergroting van NMJ. Inzetschaalbalk, 1 μm. (C) Kwantificering van het totale aantal NMJ’s per myotube en het aantal NMJ’s met één en meerdere contactpunten per myotube. Grafiek wordt weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde van vier biologische replicaties. Statistische significantie wordt bepaald met de Mann-Whitney-test met * p < 0,05. (D) Kwantificering van het percentage geïnnerveerde myobuizen. Grafiek wordt weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde van vier biologische replicaties. Dit cijfer is aangepast van Stoklund Dittlau, K. et al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Bevestiging van NMJ-functionaliteit. (A) Schematische illustratie van transiënte calciumregistraties van levende cellen van NMJ-functionaliteit in voorgemonteerde microfluïdische apparaten op dag 28 vóór en na NMJ-blokkering met tubocurarine (DTC)22. Motorneuronen in het lichtgroene compartiment worden gestimuleerd met 50 mM kaliumchloride (KCl), dat een intracellulaire motorneuronrespons veroorzaakt via de neurieten. Dit roept een instroom van calcium (Ca2+) op in myotubes, die zijn gelabeld met calciumgevoelige Fluo-4 kleurstof (donkergroen compartiment). (B) Fluo-4 fluorescentiemicrofoto’s van pre-stimulatie, intensiteitspiek en poststimulatie van een myobuis die een golf van intracellulaire calciumtoename weergeven bij motorneuronstimulatie met KCl. Inzet toont een vergroting van een geïnnerveerde actieve myotube. Schaalstaven, 100 μm. Inzetschaalbalk, 200 μm. (C) Representatieve calciuminstroomcurven in myotubes na motorneuronstimulatie met KCl (pijl) die de NMJ-functionaliteit bevestigt. Myotube 1-3 vertoont karakteristieke calciumcurven door motorneuron-myotube innervatie, terwijl myotube A-C DTC curven weergeeft na NMJ-blokkering met DTC. (D) Verhouding van motorneuron-gestimuleerde actieve myotubes op het totale aantal actieve myotubes. Dit cijfer is aangepast van Stoklund Dittlau, K. et al.18. Celillustraties zijn aangepast van Smart Server medical Art22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur 1: Motorneuronverificatie, MAB-fusie-index en NPC-kwaliteitscontrole. (A) Confocale beelden van van MAB afgeleide myotubes 10 dagen na aanvang van differentiatie. Myotubes zijn gelabeld met myotube markers: desmin, MyHC, myogenine (MyoG) en titine. Kernen zijn gekleurd met DAPI. Schaalbalk, 100 μm. (B) Kwantificering van de MAB-fusie-index 10 dagen na aanvang van de differentiatie. Bij uithongering smelten MABs samen tot multinucleated myotubes, die werden gekwantificeerd voor myotube marker positivity (AB +). Grafiek toont gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde van drie biologische replicaties. (C) Confocale beelden van iPSC-afgeleide motorneuronen op dag 28 van differentiatie, die zijn gelabeld met motorneuronmarkers NEFH, choline-acetyltransferase (ChAT) en Islet-1 naast pan-neuronale marker βIII-tubuline (Tubulin). Kernen zijn gekleurd met DAPI. Schaalstaven, 75 μm. (D) Kwantificering van het aantal cellen, die positief zijn voor motorneuronen en pan-neuronale markers (AB+). Grafiek toont gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde van drie biologische replicaties. (E) Confocale beelden van iPSC-afgeleide NPC’s op dag 11 van motorneurondifferentiatie, die zijn gelabeld met NPC-marker Olig2 en pan-neuronale marker βIII-tubuline (Tubuline). Kernen zijn gekleurd met DAPI. Schaalstaven, 50 μm. (F) Kwantificering van het aantal NPC’s, die positief zijn voor Olig2 en βIII-tubuline (AB+). Grafiek toont gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde van drie biologische replicaties. Dit cijfer is aangepast van Stoklund Dittlau, K. et al.18. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur 2: Optimalisatie van het co-cultuurprotocol (A) Confocale beelden van NMJ-vorming op dag 21 van motorneurondifferentiatie, wanneer MABs worden gezaaid op hetzelfde tijdstip als NPC’s op dag 10. NMJ’s worden geïdentificeerd door de co-lokalisatie (pijlpunten) van presynaptische markers (NEFH en SYP) en postsynaptische AChR-marker (Btx) op MyHC-gekleurde myotubes. Schaalbalk (links), 10 μm. Schaalbalk (rechts), 5 μm. (B) Helderveldbeeld van het myotubekanaal op dag 24 met spontane motorneuron-neurietkruising die de aanhechting van MABs remt. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden. Reagens Voorraad concentratie Eindconcentratie Imdm 1x 80% Foetaal runderserum 15% Penicilline / Streptomycine 5000 U/ml 0.5% L-glutamine 50x 1% Natriumpyruvaat 100m 1% Niet-essentiële aminozuren 100x 1% Insuline transferrine selenium 100x 1% bFGF (vers toegevoegd) 50 μg/ml 5 ng/ml Tabel 1: MAB-groeimedium. Medium kan 2 weken meegaan bij 4 °C. bFGF wordt vers toegevoegd op de dag van gebruik. Reagens Voorraad concentratie Eindconcentratie Dmem/F12 50% Neurobasaal medium 50% Penicilline / Streptomycine 5000 U/ml 1% L-glutamine 50x 0.5 % N-2 aanvulling 100x 1% B-27 zonder vitamine A 50x 2% β-mercaptoethanol 50 meter 0.1% Ascorbinezuur 200 μM 0,5 μM Tabel 2: Basaal medium motorneuron. Medium kan 4 weken duren bij 4 °C. Dag Reagens Voorraad concentratie Eindconcentratie Compartiment Dag 10/11 Gladgestreken agonist 10 meter 500 nM Beide Retinoïnezuur 1mm 0,1 μM Dapt 100m 10 μM BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml Dag 14 Dapt 100m 20 μM Beide BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml Dag 16 Dapt 100m 20 μM Beide BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml Cntf 0,1 mg/ml 10 ng/ml Dag 18 BDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml Motorneuron GDNF 0,1 mg/ml 10 ng/ml Cntf 0,1 mg/ml 10 ng/ml Dag 21+ BDNF 0,1 mg/ml 30 ng/ml MyoTube GDNF 0,1 mg/ml 30 ng/ml Cntf 0,1 mg/ml 30 ng/ml Agrin · 50 μg/ml 0,01 μg/ml Laminine 1mg/ml 20 μg/ml Dag 21+ Geen supplementen Motorneuron Tabel 3: Motorneuron medium supplementen. Supplementen worden vers op de dag van gebruik toegevoegd aan het basale medium van motorneuronen. Dag Reagens Voorraad concentratie Eindconcentratie Compartiment Dag 18 Dmem/F12 97% MAB Natriumpyruvaat 100m 1% Paardenserum 2% Agrin · 50 μg/ml 0,01 μg/ml Tabel 4: MAB-differentiatiemedium. Medium kan 2 weken duren bij 4 °C. Agrin wordt vers toegevoegd op de dag van gebruik.
Discussion
Het protocol beschrijft een relatief eenvoudig te gebruiken methode, die in minder dan 30 dagen menselijke motoreenheden met functionele NMJ’s genereert in commercieel verkrijgbare microfluïdische apparaten. Er wordt beschreven hoe de NMJ’s morfologisch kunnen worden beoordeeld door middel van standaardtechnieken zoals ICC en SEM en functioneel door live-cell calciumopnamen.
Een groot voordeel van dit protocol is het gebruik van stamceltechnologie. Dit zorgt voor een volledig aanpassingsvermogen waarbij NMJ’s kunnen worden geëvalueerd in zowel gezondheid als ziekte, onafhankelijk van het donorprofiel. Het model is al succesvol en nuttig gebleken in ALS-onderzoek, waar we stoornissen in neurietuitgroei, hergroei en NMJ-nummers identificeerden als nieuwe fenotypen als gevolg van mutaties in het FUS-gen18. Met dit model is het mogelijk om het onderzoek uit te breiden naar sporadische vormen van ALS, waarbij de etiologie onbekend is, door gebruik te maken van iPSC’s van sporadische ALS-patiënten. Dit biedt een voordeel ten opzichte van traditionele diermodellen, die afhankelijk zijn van transgene overexpressie van gemuteerde genen om menselijke ziekten samen te vatten23,24. Bovendien maakt ons volledig menselijke systeem potentiële recapitulatie van mensspecifieke fysiologie en ziekte mogelijk. Eerdere studies toonden de verschillen aan tussen knaagdier en menselijke NMJ-morfologie25, wat suggereert dat voorzichtigheid moet worden betracht bij het gebruik van knaagdieren om menselijke NMJ-pathologie aan te pakken. Hoewel dit systeem een relatief eenvoudige in vitro opstelling is, die de complexiteit van een in vivo model mist, was het mogelijk om aan te tonen dat de NMJ-morfologie die in de microfluïdische apparaten werd weergegeven, leek op NMJ’s van menselijke amputaten25. Bovendien maakt dit model NMJ-evaluatie mogelijk tijdens NMJ-vorming en -rijping, waardoor mogelijk vroege ziektefenotypen worden onthuld, die afwezig, niet identificeerbaar of over het hoofd worden gezien in menselijke postmortemmonsters.
MABs bieden een geldige optie om myotubes te genereren, hoewel hun beperkte overleving van 10 dagen een nadeel van het systeem is. De myotube-overleving is afhankelijk van hun hechting aan het oppervlak, die waarschijnlijk wordt aangetast door spontane samentrekkingen van de myofiberen. Na meer dan 10 dagen zullen de meeste myotubes zijn losgemaakt, waardoor de NMJ-cultuur onbruikbaar wordt. Idealiter zouden de myotubes ook worden gegenereerd uit iPSC’s. De huidige protocollen zijn echter moeilijk te reproduceren26 vanwege de variabiliteit in de fusie-index27,28,29,30.
Door gebruik te maken van in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaten hebben we een gestandaardiseerd systeem gegenereerd, dat volledig toegankelijk is. Andere NMJ-modellen bestaan31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Ze vertrouwen echter meestal op enkele compartimenten, die de compartimentering en vloeiende isolatie tussen celtypen missen, of op op maat gemaakte kweekvaten, wat de beschikbaarheid en mogelijk ook de reproduceerbaarheid verlaagt. De microfluïdische apparaten die voor dit protocol worden gebruikt, kunnen worden gekocht met microgrooves van verschillende lengtes, wat verdere analyse mogelijk maakt, zoals axonaal transport43,44 of axotomie18,45,46 onderzoeken. De vloeiende isolatie tussen compartimenten maakt verder een gecompartimenteerde medicamenteuze behandeling van motorneuronen of myotubes mogelijk, wat gunstig kan zijn bij de ontwikkeling van therapieën. Er zijn meer bedrijven ontstaan die gespecialiseerd zijn in microfluïdica, wat zich heeft opengesteld voor een grote selectie van apparaatontwerp en -functies, waardoor de toegankelijkheid voor in vitro onderzoek verder wordt bevorderd.
Tot slot hebben we een protocol ontwikkeld dat een betrouwbare, veelzijdige en eenvoudige methode biedt om menselijke motoreenheden met functionele NMJ’s te kweken.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Nikky Corthout en Sebastian Munck van LiMoNe, Onderzoeksgroep Moleculaire Neurobiologie (VIB-KU Leuven) voor hun advies over live-cell calcium transient fluorescentie opnames. Dit onderzoek werd ondersteund door de Fulbright Commission naar België en Luxemburg, KU Leuven (C1 en “Opening the Future” Fund), het VIB, het Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (IWT; SBO-iPSCAF), het “Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen” (FWO-Vlaanderen), Target ALS, de ALS Liga België (A Cure for ALS), de Belgische Overheid (Interuniversitair Attractiepolen Programma P7/16 geïnitieerd door het Federaal Wetenschapsbeleid), de Thierry Latran Foundation en de “Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires” (ABMM). T.V. en J.B. worden ondersteund door doctoraatsbeurzen toegekend door FWO-Vlaanderen.
Materials
| α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | B35451 | Antibody (1:1000) |
| Acetic Acid | CHEM-Lab NV | CL00.0116.1000 | Coating component. H226, H314. P280 |
| Aclar 33C sheet (SEM sheet) | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | Thickness: 7.8 mil |
| Agrin (recombinant human protein) | R&D systems | 6624-AG-050 | Media supplement |
| Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Antibody (1:1000) |
| Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Antibody (1:1000) |
| Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Antibody (1:1000) |
| Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Antibody (1:1000) |
| Ascorbic acid | Sigma | A4403 | Media component |
| βIII-tubulin (Tubulin) | Abcam | ab7751 | Antibody (1:500) |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | Media component. H317. P280. |
| B-27 without vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | Media component |
| BDNF (brain-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-02B | Growth factor |
| bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) | Peprotech | 100-18B | Growth factor |
| Choline acetyltransferase (ChAT) | Millipore | ab144P | Antibody (1:500) |
| Collagen from calfskin | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Coating component |
| CNTF (ciliary neurotrophic factor) | Peprotech | 450-13B | Growth factor |
| DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Immunocytochemistry component |
| DAPT | Tocris Bioscience | 2634 | Media supplement |
| Desmin | Abcam | Ab15200 | Antibody (1:200) |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Media component |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | no calcium, no magnesium |
| Ethanol | VWR | 20.821.296 | Sterilization. H225. P280 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | Media component |
| Fluo-4 AM live cell dye | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Calcium imaging dye |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | Immunocytochemistry component |
| GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-10B | Growth factor |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1020 | Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280. |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Media component |
| Human alkaline phosphatase | R&D systems | MAB1448 | Antibody |
| ImageJ software | NIH | ICC analysis | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | Media component |
| Insulin transferrin selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | Media component |
| Islet-1 | Millipore | ab4326 | Antibody (1:400) |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Cryopreservation component |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020-1MG | Coating component and media supplement |
| Leica SP8 DMI8 confocal microscope | Leica | ICC confocal microscopy | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Media component |
| Myogenin (MyoG) | Abcam | Ab124800 | Antibody (1:500) |
| Myosin heavy chain (MyHC) | In-house, SCIL | Antibody (1:20) | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | Media component |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Coating and media component |
| Neurofilament heavy chain (NEFH) | Abcam | AB8135 | Antibody (1:1000) |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Live-cell calcium imaging microscopy | |
| NIS-Elements AR 4.30.02 software | Nikon | Live-cell calcium imaging analysis | |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Media component |
| Normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | Immunocytochemistry component |
| Olig2 | IBL | 18953 | Antibody (1:1000) |
| Parafilm M | Sigma | P7793-1EA | Storing equipment |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280. |
| Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Media component |
| Petri dish (3 cm) | nunc | 153066 | Diameter: 3 cm |
| Petri dish (10 cm) | Sarstedt | 833.902 | Diameter: 10 cm |
| Plate (6-well) | Cellstar Greiner bio-one | 657160 | Culture plate |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher Scientific | P3000MP | Fluo-4 dye solvent |
| Poly-L-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Coating component |
| Potassium chloride | CHEM-Lab NV | CL00.1133.1000 | Calcium imaging reagent |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280. |
| RevitaCell supplement | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | ROCK inhibitor solution |
| Smoothened agonist | Merch Millipore | 566660 | Media supplement |
| Sodium cacodylate buffer | Sigma | C0250 | Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280. |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Media component |
| Synaptophysin (SYP) | Cell Signaling | 5461S | Antibody (1:1000) |
| T75 flask | Sigma | CLS3276 | Culture plate |
| Titin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 9D10 | Antibody (1:300) |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280 |
| TrypLE express | Thermo Fisher Scientific | 12605010 | MAB dissociation solution |
| Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379-100G | Acetylcholine receptor blocker. H301. P280. |
| XonaChips pre-assembled microfluidic device | Xona Microfluidics | XC150 | Microgroove length: 150 μm |
| Xona Silicone microfluidics device | Xona Microfluidics | SND75 | Microgroove length: 75 μm |
References
- Plomp, J. J., Kaminski, H. J., Kusner, L. L. Neuromuscular junction physiology and pathophysiology. Myasthenia Gravis and Related Disorders. , 1-12 (2018).
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The ‘dying-back’ phenomenon of motor neurons in ALS. Journal of Molecular Neuroscience. 43 (3), 470-477 (2010).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathology and Applied Neurobiology. 36 (2), 133-156 (2010).
- Rowland, L. P., Shneider, N. A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1688-1700 (2001).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
- Martineau, &. #. 2. 0. 1. ;., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. eLife. 7, 41973 (2018).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models and Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
- Nair, G., et al. Diffusion tensor imaging reveals regional differences in the cervical spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. NeuroImage. 53 (2), 576-583 (2010).
- So, E., et al. Mitochondrial abnormalities and disruption of the neuromuscular junction precede the clinical phenotype and motor neuron loss in hFUSWT transgenic mice. Human Molecular Genetics. 27 (3), 463-474 (2018).
- Tallon, C., Russell, K. A., Sakhalkar, S., Andrapallayal, N., Farah, M. H. Length-dependent axo-terminal degeneration at the neuromuscular synapses of type II muscle in SOD1 mice. Neuroscience. 312, 179-189 (2016).
- Walker, A. K., et al. Functional recovery in new mouse models of ALS/FTLD after clearance of pathological cytoplasmic TDP-43. Acta Neuropathologica. 130 (5), 643-660 (2015).
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4516-4519 (1977).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861 (2017).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2014).
- Giacomazzi, G., Péault, B. M., et al. Isolation of mesoangioblasts: A subset of pericytes with myogenic potential. Pericytes: Methods and Protocols. , 155-167 (2021).
- Stoklund Dittlau, K., et al. Human motor units in microfluidic devices are impaired by FUS mutations and improved by HDAC6 inhibition. Stem Cell Reports. , (2021).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 44530 (2019).
- Burkin, D. J., Kim, J. E., Gu, M., Kaufman, S. J. Laminin and alpha 7 beta 1 integrin regulate agrin-induced clustering of acetylcholine receptors. Journal of Cell Science. 113 (16), 2877-2886 (2000).
- Zhang, B. G. X., et al. Combination of agrin and laminin increase acetylcholine receptor clustering and enhance functional neuromuscular junction formation In vitro. Developmental Neurobiology. 76 (5), 551-565 (2016).
- . Smart Servier Medical Art Available from: https://smart.servier.com/ (2021)
- Morrice, J. R., Gregory-Evans, C. Y., Shaw, C. A. Animal models of amyotrophic lateral sclerosis: A comparison of model validity. Neural Regeneration Research. 13 (12), 2050-2054 (2018).
- Greek, R., Hansen, L. A. Questions regarding the predictive value of one evolved complex adaptive system for a second: Exemplified by the SOD1 mouse. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 113 (2), 231-253 (2013).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Jiwlawat, N., Lynch, E., Jeffrey, J., Van Dyke, J. M., Suzuki, M. Current progress and challenges for skeletal muscle differentiation from human pluripotent stem cells using transgene-free approaches. Stem Cells International. , 6241681 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- vander Wal, E., et al. Large-scale expansion of human iPSC-derived skeletal muscle cells for disease modeling and cell-based therapeutic strategies. Stem Cell Reports. 10 (6), 1975-1990 (2018).
- Choi, I. Y., et al. Concordant but varied phenotypes among duchenne muscular dystrophy patient-specific myoblasts derived using a human iPSC-based model. Cell Reports. 15 (10), 2301-2312 (2016).
- Choi, I. Y., Lim, H. T., Che, Y. H., Lee, G., Kim, Y. J. Inhibition of the combinatorial signaling of transforming growth factor-beta and NOTCH promotes myotube formation progenitor cells. Cells. 10 (7), 1649 (2021).
- Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
- Guo, X., Gonzalez, M., Stancescu, M., Vandenburgh, H. H., Hickman, J. J. Neuromuscular junction formation between human stem cell-derived motoneurons and human skeletal muscle in a defined system. Biomaterials. 32 (36), 9602-9611 (2011).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128 (6), 1241-1252 (2015).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Lin, C. Y., et al. IPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), 124299 (2019).
- Puttonen, K. A., et al. Generation of functional neuromuscular junctions from human pluripotent stem cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 473 (2015).
- Umbach, J. A., Adams, K. L., Gundersen, C. B., Novitch, B. G. Functional neuromuscular junctions formed by embryonic stem cell-derived motor neurons. PLoS ONE. 7, 36049 (2012).
- Bellmann, J., et al. A customizable microfluidic platform for medium-throughput modeling of neuromuscular circuits. Biomaterials. 225, 119537 (2019).
- Mills, R., et al. Neurturin is a PGC-1α1-controlled myokine that promotes motor neuron recruitment and neuromuscular junction formation. Molecular Metabolism. 7, 12-22 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose-response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Southam, K. A., King, A. E., Blizzard, C. A., McCormack, G. H., Dickson, T. C. Microfluidic primary culture model of the lower motor neuron-neuromuscular junction circuit. Journal of Neuroscience Methods. 218 (2), 164-169 (2013).
- Naumann, M., et al. Impaired DNA damage response signaling by FUS-NLS mutations leads to neurodegeneration and FUS aggregate formation. Nature Communications. 9 (1), 335 (2018).
- Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments. (159), e60993 (2020).
- Nijssen, J., Aguila, J., Hoogstraaten, R., Kee, N., Hedlund, E. Axon-seq decodes the motor axon transcriptome and its modulation in response to ALS. Stem Cell Reports. 11 (6), 1565-1578 (2018).
- Melamed, Z., et al. Premature polyadenylation-mediated loss of stathmin-2 is a hallmark of TDP-43-dependent neurodegeneration. Nature Neuroscience. 22 (2), 180-190 (2019).
Cite This Article
Stoklund Dittlau, K., Krasnow, E. N., Fumagalli, L., Vandoorne, T., Baatsen, P., Kerstens, A., Giacomazzi, G., Pavie, B., Rossaert, E., Beckers, J., Sampaolesi, M., Van Damme, P., Van Den Bosch, L. Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (175), e62959, doi:10.3791/62959 (2021).