In situ Hybridation chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre au cours du développement de Mesonephros
Summary
Le poisson-zèbre est un modèle important pour comprendre le développement des reins. Ici, un protocole d’hybridation in situ est optimisé pour détecter l’expression des gènes chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre pendant le développement du mésonéphros.
Abstract
Le poisson-zèbre forme deux structures rénales au cours de sa vie. Le pronephros (rein embryonnaire) se forme au cours du développement embryonnaire et commence à fonctionner 2 jours après la fécondation. Composé de seulement deux néphrons, le pronephros sert de seul rein pendant la vie larvaire jusqu’à ce que plus de fonction rénale soit nécessaire en raison de l’augmentation de la masse corporelle. Pour faire face à cette demande plus élevée, le mésonéphros (rein adulte) commence à se former pendant la métamorphose. Les nouveaux néphrons primaires fusionnent avec les pronéphros et forment des lumens connectés. Ensuite, les néphrons secondaires fusionnent avec les néphrons primaires (et ainsi de suite) pour créer un réseau de branchement dans les mésonéphros. La grande majorité de la recherche est axée sur les pronéphros en raison de la facilité d’utilisation des embryons. Ainsi, il est nécessaire de développer des techniques pour étudier les larves et les poissons juvéniles plus âgés et plus gros afin de mieux comprendre le développement des mésonéphros. Ici, un protocole d’hybridation in situ pour l’analyse de l’expression génique est optimisé pour la pénétration de la sonde, le lavage des sondes et des anticorps, et le blanchiment des pigments pour mieux visualiser le mésonéphros. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée pour marquer les cellules progénitrices et les tubules distaux des néphrons naissants. Ce protocole comble une lacune dans la recherche sur les mésonéphros. Il s’agit d’un modèle crucial pour comprendre comment les nouveaux tissus rénaux se forment et s’intègrent aux néphrons existants et fournir des informations sur les thérapies régénératives.
Introduction
L’embryon de poisson-zèbre est un modèle important pour étudier le développement tissulaire en raison de sa petite taille, de sa transparence, des outils disponibles et de sa survie sans se nourrir jusqu’à cinq jours1,2. Il a grandement contribué à la compréhension du développement des reins et à la conservation entre le poisson-zèbre et les mammifères3,4,5. Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des fluides, la filtration du sang et l’excrétion des déchets6. Le néphron, l’unité fonctionnelle du rein, comprend un filtre sanguin relié à un long tubule. Chez le poisson-zèbre, deux structures rénales se forment tout au long de sa vie. Le pronephros (le rein embryonnaire temporaire) se forme d’abord au cours du développement précoce. Il se compose de deux néphrons courant le long de l’axe antérieur-postérieur et devient fonctionnel environ 2 jours après la fécondation (dpf). L’utilité du pronephros réside dans sa simplicité, n’ayant que deux néphrons qui sont pour la plupart linéaires et faciles à visualiser (bien que le tubule alambiqué proximal commence à s’enrouler à trois dpf)3. Cela a facilité non seulement l’étude de son développement précoce à partir du mésoderme intermédiaire, mais aussi le modèle de segmentation et la réparation des tubules7,8.
L’utilité du poisson-zèbre devient limitée après cinq dpf, lorsque le jaune est diminué et que les larves dépendent de l’alimentation du système aquatique9. Vers l’âge de 2 semaines, les larves subissent une métamorphose en juvéniles, où de nouveaux tissus se forment et d’anciens tissus sont perdus et/ou réorganisés9. C’est aussi à ce moment-là que le mésonéphros (le rein adulte permanent) se forme10,11,12. Le premier néphron adulte se forme près de la sixième somite et fusionne avec le tubule distal précoce du pronephros. Des néphrons supplémentaires sont ajoutés postérieurs à cette position dans un premier temps, mais aussi vers l’avant plus tard. Les néphrons primaires de cette première onde fusionnent avec les tubules des pronephros et partagent une lumière commune pour déposer leurs déchets. Les néphrons secondaires se forment dans l’onde suivante et fusionnent avec les néphrons primaires. Ce processus répétitif crée un mésonéphros ramifié, un peu semblable au rein de mammifère. Vraisemblablement, le pronephros finit par perdre son identité de tubule et devient deux canaux collecteurs majeurs où tous les néphrons drainent leurs déchets13.
Avant la formation du premier néphron adulte, des cellules progénitrices uniques commencent à apparaître chez les larves d’environ 4 mm (longueur totale) (~ 10 dpf). Ces cellules, qui sont marquées dans la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), adhèrent aux pronéphros et semblent migrer vers de futurs sites de néphrogenèse. Les cellules individuelles fusionnent en grappes, qui se différencient en nouveaux néphrons12. On ne sait pas où résident ces cellules ou quels gènes elles expriment avant le début de la mésonéphrogenèse.
Comprendre le développement des mésonéphros fournit des informations sur le rein des mammifères d’une manière que les pronéphros ne peuvent pas. Ceux-ci incluent la formation d’agrégats néphrogéniques à partir de cellules progénitrices uniques, l’intégration fonctionnelle de nouveaux néphrons avec les cellules existantes et la morphogenèse ramifiée. Cependant, il y a des limites à l’étude du développement postmbryonique. Les larves sont moins transparentes en raison de leur plus grande taille et de leur pigmentation. La chronologie du développement n’est pas synchrone entre les animaux individuels et dépend fortement de facteurs environnementaux, tels que l’alimentation et l’encombrement9,14. Bien qu’il existe des réactifs knockdown, ils sont moins efficaces chez les larves que chez les embryons15. Dans ce protocole, une méthode d’hybridation in situ pour déterminer l’expression des gènes au cours du développement du mésonephros du poisson-zèbre est décrite. Plusieurs étapes sont optimisées pour augmenter la visualisation des mésonéphros et la pénétration et le lavage de la sonde et de l’anticorps. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée avec une sonde pour l’EGFP pour marquer les cellules progénitrices uniques, les agrégats néphrogéniques et les tubules distaux des néphrons naissants. Cette méthode fournira une compréhension plus approfondie du développement des mésonéphros et un aperçu des thérapies régénératives.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode d’hybridation in situ décrite ici vise à étudier le développement du mésonéphros. Cependant, il peut être appliqué pour étudier le développement d’autres tissus et organes pendant la métamorphose, tels que l’intestin, le système nerveux, les écailles et la pigmentation14. Des sondes peuvent être générées pour des gènes endogènes ou des marqueurs fluorescents dans des lignées transgéniques.
Il est essentiel que les larves r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement a été fourni par la Pennsylvania Academy of Science, le Commonwealth of Pennsylvania Biologists et l’Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology et Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) a été fournie par le Dr Neil Hukriede (Université de Pittsburgh).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
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