في سيتو التهجين في يرقات حمار وحشي والأحداث خلال تطوير Mesonephros
Summary
الحمار الوحشي هو نموذج مهم لفهم نمو الكلى. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في يرقات حمار وحشي والأحداث أثناء تطور الميكسونفروس.
Abstract
تشكل سمكة الحمار الوحشي هيكلين للكلى في حياتها. تتشكل الفروس (الكلى الجنينية) أثناء النمو الجنيني وتبدأ في العمل بعد يومين من الإخصاب. تتكون من اثنين فقط من الكليفرونات ، يعمل الفروس ككلية وحيدة خلال حياة اليرقات حتى يلزم المزيد من وظائف الكلى بسبب زيادة كتلة الجسم. للتعامل مع هذا الطلب المرتفع ، يبدأ الموسونيفروس (الكلى البالغة) في التشكل أثناء التحول. الكلية الأولية الجديدة تنصهر إلى المعرضة وتشكل التجويفات المتصلة. ثم، تنصهر الكلية الثانوية إلى تلك الأولية (وهلم جرا) لإنشاء شبكة متفرعة في mesonephros. وتركز الغالبية العظمى من البحوث على المعرضة بسبب سهولة استخدام الأجنة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تطوير تقنيات لدراسة اليرقات القديمة والأكبر والأسماك الأحداث لفهم أفضل لتطور الميكسونيفروس. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع لتحليل التعبير الجيني لاختراق المسبار ، وغسل المسابير والأجسام المضادة ، وتبييض الأصباغ لتصور أفضل للمسونيفروس. يستخدم خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا لتسمية خلايا السلف والأنابيب البعيدة من الكليرونات الوليدة. هذا البروتوكول يسد فجوة في أبحاث الميكسونفروس. وهو نموذج حاسم لفهم كيفية تشكل أنسجة الكلى الجديدة والاندماج مع الكلية الموجودة وتوفير رؤى في العلاجات التجديدية.
Introduction
جنين حمار وحشي هو نموذج مهم لدراسة تطور الأنسجة بسبب صغر حجمه وشفافيته وأدواته المتاحة وبقائه دون تغذية لمدة تصل إلى خمسة أيام1,2. وقد ساهم بشكل كبير في فهم نمو الكلى والحفاظ على بين حمار وحشي والثدييات3،4،5. تلعب الكلية دورا أساسيا في الحفاظ على التوازن السائل ، وتصفية الدم ، وإفراز النفايات6. وتتألف الكلية، وهي الوحدة الوظيفية للكلى، من فلتر دم متصل بأنابيب طويلة. في حمار وحشي، اثنين من هياكل الكلى تشكل طوال حياتها. تتشكل الفروس (الكلية الجنينية المؤقتة) أولا أثناء النمو المبكر. وهو يتألف من اثنين من الكلية التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي ويصبح وظيفيا في حوالي 2 أيام بعد الإخصاب (dpf). تكمن فائدة الفروس في بساطته ، حيث يبدأ اثنان فقط من الكليرونات التي هي في الغالب خطية وسهلة التصور (على الرغم من أن أنبوب الأنبوب الملتوي القريب يبدأ في اللف عند ثلاثة dpf)3. وقد سهل هذا ليس فقط دراسات تطورها المبكر من mesoderm المتوسطة، ولكن أيضا نمط التقسيم وإصلاح أنبوبي7،8.
تصبح فائدة سمك الحمار الوحشي محدودة بعد خمسة dpf ، عندما يتضاءل الصفار وتعتمد اليرقات على التغذية في النظام المائي9. في حوالي 2 أسابيع من العمر ، تخضع اليرقات للتحول إلى أحداث ، حيث تتشكل أنسجة جديدة وتضيع الأنسجة القديمة و / أو إعادة تنظيم9. هذا هو أيضا عندما mesonephros (الكلى الكبار الدائم) تشكل10،11،12. يتشكل أول نييفرون بالغ بالقرب من السوسميت السادس ، ويندمج مع أنبوب الأنابيب المبكر البعيدة من النضال. تتم إضافة نييفرونات إضافية إلى هذا الموقف في البداية ، ولكن أيضا نحو الأمامي في وقت لاحق. تندمج الكليرونات الأولية في هذه الموجة الأولى في أنابيب التينفروس وتشترك في تجويف مشترك لإيداع نفاياتها. تتشكل الكلية الثانوية في الموجة التالية ويندمج في الكليرونات الأولية. هذه العملية تكرار يخلق mesonephros التي تتفرع، إلى حد ما أقرب إلى الكلى الثدييات. يفترض، وs pronephros يفقد في نهاية المطاف هويته أنبوبي ويصبح اثنين من قنوات جمع الرئيسية حيث جميع nephrons استنزاف النفايات الخاصة بهم13.
قبل تشكيل أول نسل نيفيرون بالغ ، تبدأ خلايا السلف المفردة في الظهور في يرقات ~4 مم (الطول الإجمالي) (~ 10 ديسيبل في البرونيل). هذه الخلايا، التي تم وضع علامة في خط TG (lhx1a-EGFP) المعدلة وراثيا، تلتزم المعرضة ويبدو أن الهجرة إلى مواقع مستقبلية من تولد الكلية. تتجمع الخلايا المفردة في مجموعات، والتي تفرق إلى nephrons12 جديدة. ومن غير الواضح أين تتواجد هذه الخلايا أو ما هي الجينات التي تعبر عنها قبل بداية تكوين الميسونيفروجين.
فهم تطور mesonephros يوفر رؤى في الكلى الثدييات بطرق لا يمكن أن المعرضة. وتشمل هذه تشكيل المجاميع الكلية من خلايا السلف واحد، والتكامل الوظيفي للنيفرونات الجديدة مع تلك الموجودة، والمورفوجين المتفرعة. ومع ذلك ، هناك قيود على دراسة التنمية بعد الطمث. اليرقات أقل شفافية بسبب حجمها الأكبر وجود تصبغ. والجدول الزمني للنمو غير متزامن بين فرادى الحيوانات ويعتمد اعتمادا كبيرا على العوامل البيئية، مثل التغذية والزحام 9،14. على الرغم من وجود الكواشف القاضية ، إلا أنها أقل فعالية في اليرقات مقارنة بالأجنة15. في هذا البروتوكول، يتم وصف طريقة التهجين في الموقع لتحديد التعبير الجيني أثناء تطوير سمك الحمار الوحشي mesonephros. يتم تحسين عدة خطوات لزيادة التصور من mesonephros والاختراق وغسل المسبار والأجسام المضادة. يستخدم خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا جنبا إلى جنب مع مسبار ل EGFP لتسمية خلايا السلف المفردة ، والمجاميع الكلية ، وأنابيب الكلية البعيدة من الكلية الوليدة. ستوفر هذه الطريقة فهما أعمق لتطوير mesonephros ونظرة ثاقبة في العلاجات التجديدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تهدف طريقة التهجين في الموقع الموصوفة هنا إلى دراسة تطوير الميكونيفروس. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه لدراسة تطور الأنسجة والأعضاء الأخرى أثناء التحول ، مثل الأمعاء والجهاز العصبي والمقاييس والتصبغ14. يمكن إنشاء مسابير للجينات الذاتية أو علامات الفلورسنت في خطوط معدلة وراثيا.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل من قبل أكاديمية بنسلفانيا للعلوم، وكومنولث علماء الأحياء في بنسلفانيا، وجامعة إنديانا في بنسلفانيا (كلية الدراسات العليا والبحوث، وقسم البيولوجيا، وصندوق سينثيا سوشاك للبيولوجيا الجامعية للتميز). تم توفير خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا من قبل الدكتور نيل هوكريدي (جامعة بيتسبرغ).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. . The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
