Reprogramación directa de fibroblastos de ratón en melanocitos
Summary
Aquí, describimos un sistema de reprogramación directa optimizado para melanocitos y un sistema de empaquetado de virus concentrado de alta eficiencia que garantiza una reprogramación directa sin problemas.
Abstract
La pérdida de función de los melanocitos conduce al vitiligo, que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Actualmente, no existe un tratamiento efectivo a largo plazo para el vitiligo. Por lo tanto, es imperativo desarrollar un tratamiento conveniente y efectivo para el vitiligo. La tecnología de medicina regenerativa para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos parece ser un nuevo tratamiento prometedor para el vitiligo. Esto implica la reprogramación directa de las células de la piel del paciente en melanocitos funcionales para ayudar a mejorar la pérdida de melanocitos en pacientes con vitiligo. Sin embargo, este método debe probarse primero en ratones. Aunque la reprogramación directa es ampliamente utilizada, no existe un protocolo claro para la reprogramación directa en melanocitos. Además, el número de factores de transcripción disponibles es abrumador.
Aquí, se presenta un protocolo de sistema de empaquetado de lentivirus concentrados para producir factores de transcripción seleccionados para reprogramar células de la piel a melanocitos, incluidos Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 y Snai2. Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) se infectaron con el lentivirus concentrado para todos estos factores de transcripción para la reprogramación directa de los MEF en melanocitos inducidos (iMels) in vitro. Además, se examinaron estos factores de transcripción y se optimizó el sistema para la reprogramación directa a los melanocitos. La expresión de los marcadores característicos de melanina en iMels a nivel de gen o proteína aumentó significativamente. Estos resultados sugieren que la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos podría ser una nueva estrategia terapéutica exitosa para el vitiligo y confirmar el mecanismo de desarrollo de melanocitos, que proporcionará la base para una mayor reprogramación directa de fibroblastos en melanocitos in vivo.
Introduction
El vitiligo es una enfermedad de la piel que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Por diversas razones, incluyendo anomalías metabólicas, estrés oxidativo, generación de mediadores inflamatorios, desprendimiento celular y respuesta autoinmune, los melanocitos funcionales se pierden y se detiene la secreción de melanina, lo que lleva al desarrollo de vitiligo 1,2. Esta condición ocurre ampliamente y es particularmente problemática en la cara. El tratamiento principal es el uso sistémico de corticosteroides e inmunomoduladores. La fototerapia se puede utilizar para enfermedades sistémicas o locales, y existen tratamientos quirúrgicos, como el trasplante de piel perforada y el trasplante autólogo de melanocitos 3,4,5. Sin embargo, los pacientes que usan terapia farmacológica y fototerapia son propensos a la recaída, y estos tratamientos tienen efectos terapéuticos pobres a largo plazo. El tratamiento quirúrgico es traumático y sólo moderadamente efectivo 2,6. Por lo tanto, se necesita una estrategia terapéutica nueva y efectiva para el vitiligo.
La reprogramación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) revierte estas células de su estado terminal a un estado pluripotente, un proceso mediado por los factores de transcripción, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc7. Sin embargo, debido a la posibilidad de tumorigenicidad y al largo tiempo de producción, esta tecnología ha sido recibida con escepticismo cuando se aplica a entornos clínicos8. La reprogramación directa es una tecnología que hace que un tipo de célula terminal se transforme en otro tipo de célula terminal9. Este proceso se logra mediante factores de transcripción adecuados. Varias células ya han sido reprogramadas directamente con éxito, incluyendo cardiomiocitos10, neuronas11 y células ciliadas cocleares12. Algunos investigadores incluso han reprogramado el tejido de la piel directamente in situ, que se puede utilizar para la reparación de heridas13. Las ventajas de la reprogramación directa incluyen tiempos y costos de espera reducidos, menor riesgo de cáncer, menos problemas éticos y una mejor comprensión del mecanismo subyacente a la determinación del destino celular9.
Aunque el método de reprogramación directa es ampliamente utilizado, actualmente no existe un método definido para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos, especialmente debido a los numerosos factores de transcripción que deben considerarse14,15. Los factores de transcripción, Mitf, Sox10 y Pax3, se han utilizado para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos14. En contraste, la combinación de MITF, PAX3, SOX2 y SOX9 también se ha utilizado para la reprogramación directa de células de la piel en melanocitos humanos en otro estudio15. En este protocolo, a pesar del uso de un método de cribado diferente, se obtuvo el mismo resultado con la combinación de Mitf, Sox10 y Pax3 para la reprogramación directa de células de la piel en melanocitos como se describió anteriormente14. El desarrollo de un sistema para generar melanocitos a partir de otras células de la piel puede proporcionar un esquema para transformar otras células de la piel de pacientes con vitiligo en melanocitos. Por lo tanto, es crucial construir un método simple y eficiente para que esta reprogramación directa genere melanocitos con éxito.
Protocol
Representative Results
Discussion
La calidad del virus es crucial para el éxito de la reprogramación directa a los melanocitos en este protocolo. El método de envasado y concentración de virus en este protocolo es simple y fácil de repetir y no depende de ningún otro reactivo concentrado auxiliar. Este protocolo se puede seguir con éxito en la mayoría de los laboratorios. Para garantizar la calidad del virus concentrado, los siguientes puntos necesitan una atención especial. Uno es el estado celular de HEK-293T. Aunque las células HEK-293T son …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue parcialmente apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82070638 y 81770621) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20180281).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
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