Прямое перепрограммирование фибробластов мыши в меланоциты
Summary
Здесь мы описываем оптимизированную систему прямого перепрограммирования меланоцитов и высокоэффективную, концентрированную систему упаковки вирусов, которая обеспечивает плавное прямое перепрограммирование.
Abstract
Потеря функции меланоцитов приводит к витилиго, что серьезно сказывается на физическом и психическом здоровье пораженных лиц. В настоящее время не существует эффективного долгосрочного лечения витилиго. Поэтому крайне важно разработать удобное и эффективное лечение витилиго. Технология регенеративной медицины для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, по-видимому, является многообещающим новым методом лечения витилиго. Это включает в себя прямое перепрограммирование клеток кожи пациента в функциональные меланоциты, чтобы помочь улучшить потерю меланоцитов у пациентов с витилиго. Однако этот метод необходимо сначала протестировать на мышах. Хотя прямое перепрограммирование широко используется, нет четкого протокола для прямого перепрограммирования в меланоциты. Более того, количество доступных факторов транскрипции ошеломляет.
Здесь представлен протокол концентрированной системы упаковки лентивируса для получения факторов транскрипции, выбранных для перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, включая Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 и Snai2. Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF) были инфицированы концентрированным лентивирусом для всех этих факторов транскрипции для прямого перепрограммирования MEF в индуцированные меланоциты (iMels) in vitro. Кроме того, эти факторы транскрипции были проверены, и система была оптимизирована для прямого перепрограммирования на меланоциты. Экспрессия характерных маркеров меланина в iMels на уровне гена или белка была значительно повышена. Эти результаты свидетельствуют о том, что прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты может стать успешной новой терапевтической стратегией при витилиго и подтвердить механизм развития меланоцитов, что обеспечит основу для дальнейшего прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты in vivo.
Introduction
Витилиго – это кожное заболевание, которое серьезно влияет на физическое и психическое здоровье пострадавших лиц. По разным причинам, включая метаболические нарушения, окислительный стресс, генерацию медиаторов воспаления, отслойку клеток и аутоиммунный ответ, функциональные меланоциты теряются, а секреция меланина прекращается, что приводит к развитию витилиго 1,2. Это состояние встречается широко и особенно проблематично на лице. Основным методом лечения является системное применение кортикостероидов и иммуномодуляторов. Фототерапия может быть использована при системных или местных заболеваниях, и существуют хирургические методы лечения, такие как перфорированная трансплантация кожи и аутологичная трансплантация меланоцитов 3,4,5. Однако пациенты, которые используют медикаментозную терапию и фототерапию, склонны к рецидивам, и эти методы лечения имеют слабые долгосрочные терапевтические эффекты. Хирургическое лечение травматично и только умеренно эффективно 2,6. Поэтому при витилиго необходима новая и эффективная терапевтическая стратегия.
Перепрограммирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) возвращает эти клетки из их терминального состояния в плюрипотентное состояние, процесс, опосредованный факторами транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc7. Однако из-за возможности опухолегенности и длительного времени производства эта технология была встречена со скептицизмом при применении в клинических условиях8. Прямое перепрограммирование – это технология, которая заставляет один тип терминальной ячейки превращаться в другой тип терминальной ячейки9. Этот процесс достигается подходящими факторами транскрипции. Различные клетки уже были успешно перепрограммированы, включая кардиомиоциты10, нейроны11 и кохлеарные волосковые клетки12. Некоторые исследователи даже перепрограммировали ткань кожи непосредственно на месте, которая может быть использована для заживления ран13. Преимущества прямого перепрограммирования включают сокращение времени ожидания и затрат, более низкий риск развития рака, меньше этических проблем и лучшее понимание механизма, лежащего в основе определения судьбы клеток9.
Хотя метод прямого перепрограммирования широко используется, в настоящее время нет определенного метода прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, особенно из-за многочисленных факторов транскрипции, которые следует считать14,15. Факторы транскрипции, Mitf, Sox10 и Pax3, были использованы для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты14. Напротив, комбинация MITF, PAX3, SOX2 и SOX9 также использовалась для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты человека в другом исследовании15. В этом протоколе, несмотря на использование другого метода скрининга, тот же результат был получен с комбинацией Mitf, Sox10 и Pax3 для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, как описано ранее14. Разработка системы для генерации меланоцитов из других клеток кожи может обеспечить схему преобразования других клеток кожи пациентов с витилиго в меланоциты. Следовательно, крайне важно построить простой и эффективный метод для этого прямого перепрограммирования для успешной генерации меланоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Качество вируса имеет решающее значение для успеха прямого перепрограммирования на меланоциты в этом протоколе. Способ упаковки и концентрирования вирусов в этом протоколе прост и легко повторяется и не опирается на какой-либо другой вспомогательный концентрированный реагент. Этот ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (82070638 и 81770621) и Фонда естественных наук провинции Цзянсу (BK20180281).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
- Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
