בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים איכותיים מכליות עכבר קפואות המשפרים את ייצוג סוגי תאי הכליה המדולריים ומונעים את ביטוי הגנים מדיסוציאציה אנזימטית של רקמות.
Abstract
הכליות מווסתות תהליכים ביולוגיים מגוונים כגון מים, אלקטרוליטים והומאוסטזיס על בסיס חומצה. תפקודים פיזיולוגיים של הכליה מבוצעים על ידי סוגי תאים מרובים המסודרים בארכיטקטורה מורכבת על פני ציר הקורטיקומדולרי של האיבר. ההתקדמות האחרונה בתעתיק תא בודד האיצה את ההבנה של ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא בפיזיולוגיה ובמחלות של הכליה. עם זאת, פרוטוקולי דיסוציאציה של רקמות מבוססי אנזימים, המשמשים לעתים קרובות לריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq), דורשים בעיקר רקמות טריות (שאינן מאוחסנות בארכיון), מציגים תגובות עקה שעתוק, ומעדיפים את הבחירה של סוגי תאים שופעים בקליפת הכליה וכתוצאה מכך תת-ייצוג של תאי המדולה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמונע בעיות אלה. הפרוטוקול מבוסס על בידוד גרעינים ב-4 מעלות צלזיוס מרקמת כליה קפואה. גרעינים מבודדים מחתיכה מרכזית בכליה של העכבר המורכבת מקליפת המוח, מדולה חיצונית ומדולה פנימית. זה מפחית את ייצוג היתר של תאים קליפת המוח האופייניים לדגימות כליה שלמות לטובת תאים מדולריים, כך שהנתונים ייצגו את כל ציר הקורטיקומדולארי בשפע מספיק. הפרוטוקול פשוט, מהיר וניתן להתאמה ומספק צעד לקראת סטנדרטיזציה של שעתוק גרעינים בודדים במחקר כליות.
Introduction
הכליות מציגות ארכיטקטורת רקמות מורכבת ביותר. הם מורכבים מקטעים מובחנים מבחינה תפקודית ואנטומית לאורך ציר קורטקומדולרי ומתווכים פונקציות ביולוגיות, כגון ויסות נפח נוזל חוץ-תאי, איזון אלקטרוליטים או הומאוסטזיס חומצי-בסיס1.
ההתקדמות בשעתוק חד-תאי אפשרה אפיון מעמיק של רקמות מורכבות והאיצה את ההבנה של ביטוי גנים ספציפיים למקטע ולסוג התא בפיזיולוגיה של הכליה, התפתחותה ומחלותיה 2,3,4.
עם זאת, פרוטוקולי הדיסוציאציה מבוססי האנזימים המשמשים לעתים קרובות עבור scRNA-seq מציגים מספר חסרונות ואילוצים. בהתאם לפרוטוקול, הם יוצרים תגובות לחץ שעתוק והטיה לדיסוציאציה של רקמות לכיוון סוגי תאים קליפתיים קלים יותר לניתוק 5,6. למרות שפרוטוקולים המשתמשים בפרוטאזות פעילות קרה עבור כליות עובריות מסוגלים למתן שינויים בשעתוק הקשורים ללחץ, הם אינם מצליחים להתגבר על הטיית הדיסוציאציה כלפי תאי קליפת המוח וייתכן שלא ניתן להסתגל בקלות לסוגים שונים של רקמות כליות חולות7. בנוסף, גישות חד-תאיות אינן תואמות בקלות לדגימות רקמה קפואות, מה שמגביל את היישום שלהן בעיקר לרקמות טריות שאינן מאוחסנות בארכיון, ובכך הופכות את איסוף הרקמה לגורם מגביל6.
ריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNA-seq) יכול לעקוף מגבלות אלה 8,9. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מפרוסה מרכזית של רקמת כליה קפואה של עכבר בוגר (איור 1)10. הפרוטוקול שלנו פשוט ומספק גישה סטנדרטית להשגת ספריות ריצוף RNA עם ייצוג מאוזן של סוגי תאי כליה מגוונים עבור מודלים ניסיוניים שאינם כרוכים בשינויים אזוריים חזקים ברקמות. במקרה האחרון, הפרוטוקול שלנו יכול להתבצע גם עם כליות שלמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
תעתיק חד-תאי מקדם את ההבנה של ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא בפיזיולוגיה ובמחלות של הכליה. כאן, סיפקנו שיטה פשוטה וניתנת לשחזור לבידוד גרעינים בודדים באיכות גבוהה מרקמת כליות עכבר קפואה עבור snRNA-seq בצורה סטנדרטית.
עבור snRNA-seq, חיוני להשתמש בגרעינים באיכות גבוהה כקלט ליצירת ספריות ולהימנע מהתפרקות RNA במהלך עיבוד רקמות. לכן, הדגירה של חלקי רקמה בתמיסת ייצוב RNA מיד לאחר הדיסקציה חיונית להגנה ולייצוב RNA תאי ומאפשרת לאחסן דגימות ב – 80 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן. כאשר מיישמים פרוטוקול זה על רקמות קפואות ללא טיפול בתמיסת ייצוב RNA, כגון חומר ארכיוני, נדרשת ריצת ניסוי, ויש להעריך את איכות ה-RNA מכיוון שראינו אובדן משמעותי של שלמות ה-RNA ברקמה קפואה ללא דגירה מוקדמת בתמיסת ייצוב RNA.
באופן כללי, טיפול מתאים בדגימות הוא חיוני למקסום ההתאוששות של גרעינים בודדים שלמים. כל שלבי ההשעיה צריכים להתבצע על ידי צנרת בזהירות כדי למנוע לחץ גזירה ונזק פיזי. מאגרים עבור השעיית הגרעינים הסופית ומיון הגרעינים צריכים להכיל BSA כדי למנוע אובדן וצבירה של גרעינים.
נפחי חיץ בפרוטוקול זה ממוטבים עבור דגימות רקמות קטנות מאוד (~ 15 מ”ג). זה קריטי כדי להבטיח ליזה מלאה התא ושטיפה מספקת כדי ליצור מתלים באיכות גבוהה. גושי רקמה גדולים יותר או דגימות כליה שלמות יגרמו לריכוזי גרעינים מוגזמים המובילים לגושים וצבירה, שפע גבוה של RNA סביבתי ואיכות תרחיף ירודה באופן כללי. אם דגימות גדולות יותר או רקמות אחרות מעובדות, מומלץ מאוד לבצע ריצות ניסיון כדי לקבוע נפחי חיץ אופטימליים עבור רמות RNA סביבתי מינימליות. איכות וריכוזי הגרעינים והרנ”א צריכים להיבדק בקפידה מכיוון שעומס יתר גורם לביצועים ירודים באופן כללי.
בנוסף, כמויות גדולות של פסולת תאים, הגורמות לרמות גבוהות של RNA סביבתי שאינן קשורות לגרעינים בודדים, משפיעות לרעה על תוצאות הריצוף. הבהרת תרחיף הגרעינים על ידי צנטריפוגה באמצעות כרית סוכרוז מקלה במידה מסוימת על בעיה זו, אך היא יכולה גם להוביל להטיה בייצוג סוג התא על ידי בחירה נגדית כנגד גרעינים צפופים וקטנים הקיימים, למשל, בתאי מערכת החיסון16. אם זה מדאיג, יש להשמיט את שיפוע הסוכרוז. לעומת זאת, מצאנו כי ציטומטריית זרימה המבוססת על צביעת DAPI הייתה קריטית להפחתת כמות פסולת התא על מנת לייצר תרחיף גרעינים יחיד באיכות גבוהה.
לבידודם של גרעינים בודדים יתרונות ניכרים בהשוואה לגישות חד-תאיות8. הוא תואם לרקמות קפואות כראוי, מה שהופך את אוסף הרקמה לגמיש יותר, ועוקף את הצורך בדיסוציאציה רקמתית מבוססת אנזים, שיכולה להציג תגובות מתח שעתוק 6,17. יתר על כן, הוא מתגבר על הטיית הדיסוציאציה המעדיפה את הבחירה של סוגי תאים הניתנים לניתוק בקלות של קליפת הכליה, מה שעלול להוביל לייצוג חסר של סוגי תאים מדולריים בכמה גישות מבוססות אנזימים 5,6,10.
שימוש בחתיכת כליה מרכזית במקום ברקמת כליה שלמה חוסך משאבים ומתקן ייצוג יתר של סוגי תאים שופעים כפי שתואר קודםלכן 10. עם זאת, בהתאם למודל העכבר או לפנוטיפ שנחקר, ייתכן שיועיל להשתמש בדגימות כליה שלמות במקום בפרוסה אמצעית אחת. דגימות כליה שלמות עשויות לייצג יותר את פרופורציות התאים האמיתיות, או שינויים המתרחשים בכליה כולה, בעוד שפרוסה אמצעית קצוצה הוכיחה יתרון לפנוטיפים מדולריים או כאשר חומר הדגימה היה מוגבל. החלטה זו, אם כן, היא מאוד ספציפית למשתמש ויש לשקול אותה בזהירות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפלטפורמת הגנומיקה המדעית במרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית באגודת הלמהולץ, ברלין על התמיכה הטכנית.
JL ו- KMSO נתמכו על ידי קבוצת ההדרכה למחקר של קרן המחקר הגרמנית (DFG) GRK 2318 ועל ידי יחידת המחקר FOR 2841. KMSO נתמך על ידי מענק מחקר שיתופי 1365. AB נתמך על ידי מימון מפרס גוטפריד וילהלם לייבניץ של DFG שהוענק ל-NR.
Materials
| Cell sorter | – | – | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
| 4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
| D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
| DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
| Ethanol, 70 % | – | – | |
| FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
| Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
| Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
| Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
| pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
| Razor blades | – | – | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
| RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |
References
- Thomas, R. S. Kidney modeling and systems physiology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1 (2), 172-190 (2009).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Park, J., Liu, C. L., Kim, J., Susztak, K. Understanding the kidney one cell at a time. Kidney International. 96 (4), 862-870 (2019).
- Clark, A. R., Greka, A. The power of one: advances in single-cell genomics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 16 (2), 73-74 (2020).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Muto, Y., et al. Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney. Nature Communications. 12 (1), 2190 (2021).
- Hinze, C., et al. Kidney single-cell transcriptomes predict spatial corticomedullary gene expression and tissue osmolality gradients. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (2), 291 (2021).
- Berger, S. L. Isolation of cytoplasmic RNA: ribonucleoside-vanadyl complexes. Methods in Enzymology. 152, 227-234 (1987).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease. Science. 360 (6390), 758-763 (2018).
- Kirita, Y., Wu, H., Uchimura, K., Wilson, P. C., Humphreys, B. D. Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15874-15883 (2020).
- Schneeberger, S., et al. The neuroinflammatory interleukin-12 signaling pathway drives Alzheimer’s disease-like pathology by perturbing oligodendrocyte survival and neuronal homeostasis. bioRxiv. , 441313 (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
