光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

使用されるすべてのプロトコルは、制度的動物管理・使用倫理委員会(PRBB-IACUEC)によって承認され、国内および欧州の規制に従って実施されています。すべての実験は、3Rの原理に従って行った。ゼブラフィッシュ(ダヨ・レリオ)は、前述のように維持した。 1. 単離胚性ゼブラフィッシュ前駆細胞の作製 マイクロピペットおよびアガロース製剤注: 完全なゼブラフィッシュ胚マイクロインジェクションプロトコルについては、reference45 を参照してください。 マイクロピペットプーラーで、1.0mmのガラスキャピラリーを引っ張って2本の針45を得る。未使用の針をプレイドウクッションに取り付けられた150mmのペトリ皿に保管するか、または裏返しのラボテープリングに保管して、輸送中の薄い先端を損傷から保護します。 E3(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4)の1%超純粋アガロースを標準キッチン/ラボマイクロ波で10 sで溶融します。アガロースが溶けるまで、短時間(数秒)の混合物を繰り返し加熱します。 アガロースが完全に溶けたら、少し冷ましてから10cmのペトリ皿に注ぎます。気泡の出現を避けるためにアガロースの上部に三角形のマイクロインジェクション金型( 材料表を参照)をゆっくりと追加します。金型を押し込まないで、アガロース表面に残ります。 アガロースが完全に固まったら、アガロースの破断を避けるために穏やかな力を加えることによって、三角形のカビを非常にゆっくりと取り除く。プレートは、2〜4週間4°Cで逆さまに保存することができます。 マイクロインジェクションの30分前に、冷蔵庫からプレートを取り出し、28°Cに予温したE3を加えて室温で安定させます。 注射ミックス製剤 注入混合物を調製するために、RNase遊離水で1:5の比率で1μmマイクロビーズ(ポリスチレン、非蛍光)を希釈する。 蛍光マーカーの一過発現または組換え遺伝子構築物の発現および/またはモルフォリーノの目的の濃度での共噴射のためのmRNAを調製する。注:マイクロビーズの共注射のための典型的な注射混合物と1胚当たり100 pgのmRNAを標識する、 例えば、H2A-mCherryを有する核は、1μLのビーズ+1μLのmRNA(ストック濃度は1μg/μL)+2.5μLのRNAフリーウォーター+0.5μLのフェノールレッド(ストック溶液0.5%、フェノールレッドは必須ではない;それは注入された滴のより良い視覚化のために使用されるが、非標識注入の視覚化のために使用される。落下は経験豊富な実験者のためにも表示されます)。RNA注射はまた、注入された胚を選択するのに有用である。蛍光マイクロビーズは、非蛍光の代わりにそれらを可視化するために注入することができる。 マイクロインジェクション針のローディングとキャリブレーション タイムゲートオプションを使用してマイクロインジェクタの電源を入れます。この設定は、射出量を正しく調整するために非常に重要です。約 500 ミリ秒で、ゲージ時間を設定します。 マイクロローダーピペットを使用して注射混合物の3 μLを針にロードします。 マイクロマニピュレーターに針を挿入し、しっかりと密封します。マイクロマニピュレータが良好な位置にあり、射出プレート上のx-y方向に移動するのに十分な自由度があるかどうかを確認します。 top45に鉱物油を一滴落とし、注入ミックスの滴を鉱物油に直接排出するマイクロメートルスライド(5 mm/100分割)を使用して、ドロップサイズを測定します。 急な角度で鋭い鉗子で針を切り抜き、鋭い尖った先端を生成します。0.5 nLの注入された材料に対応する0.1 mmに滴りのサイズを調節する。注:針を切断してこのボリュームを超えた場合は、新しい針でキャリブレーション手順をやり直すことをお勧めします。マイクロインジェクターの八方修正時間は、ドロップボリュームに合わせて若干調整できます。しかし、短い座数は大きな針径に相当し、胚に損傷を与える可能性がある。 1細胞段階におけるゼブラフィッシュ胚の微小注入 最初の細胞分裂が起こる前に、ビーズ混合物を直接1細胞(zygote)段階胚に直接注入するために、ゼブラフィッシュ胚を収集する。注:これは、マイクロスフェアの適切な分布と実験が行われる後の発達段階(ブラストラガストラステージ)で、細胞あたり少なくとも1つの微小球を有する単離されたブラストミアの十分な高い収率を保証します。インデントの実験は、セル内に 2 つの球がある場合でも実行できますが、ビーズのないセルは除外する必要があります (球のないインデントは可能な場合でも)。AB野生型株はこのプロトコルで使用されたが、他の株、例えばTLを使用することができる。 プラスチック製のパスツールピペットを使用して、 図1Aに示すように、1細胞段階の胚(zygote)を、前温めの三角形の1%アガロース型に入れます。 胚が浮かび上がらないように、同じピペットで余分な培地を取り除きます。ブラシを 介して 三角形の型にゆっくりと胚を押し込みます。正しい向きを容易にするために、胚間にいくらかのスペースを置いてください(図1B)。 図1Bに示すように、胚が横方向に向き合うように胚をブラシにそっと合わせ、ジゴテの1つの細胞がはっきりと見えるようにします。マイクロインジェクションの理想的な向きは、図1Cに示すように、胚の1つの細胞が針方向(胚の動物極を介した注射)または黄身細胞に対する反対の方向(胚の植物極を介した注射)に向いているときに到達する。 片手で皿を持ち、もう一方の手を使ってマイクロマニピュレーターを使用して針先を配置します。針先を胚に向かって下げます。 絨毛を突き刺し、体型顕微鏡を通して手順を監視しながら針で1細胞胚に入ります。 図1Cに示すように、針の正しい配置と、注入されたドロップの正しい位置を確認します。 すべての胚について繰り返します:針を上に移動し、次の胚が中央に配置されるまで胚で皿をスライドさせ、針を下げ、注射します。 胚のセット全体を注入したら、いくつかのE3を洗い流すことによってアガロースカビ/ペトリ皿から胚を取り除き、プラスチック製のパスツールピペットを使用して新しいペトリ皿に入れます。マイクロインジェクションの手順で胚の乾燥を避けるために、注入プレートに十分な媒体を置くことをお勧めします。 所望の胚数が注入されるまで手順を繰り返す。胚は、ビーズの最大かつ均質な広がることを確実にするために、1つの細胞段階にある必要があります。注:この手順は初期の胚胚に最適化されており、異なる発達段階を調査する場合は最適化する必要があります。 注入した胚をインキュベーター内に28-31°Cで約4時間、または所望の段階(図1D)まで入れてから、一次細胞培養のプロトコルを進める。注:必要に応じて、胚が生存を確実にし、毒性アーティファクトを排除するために、ブラストラ段階(または所望の測定時点)を超えて発達させます。幼虫の段階では、0.75%アガロースにトリケーヌを用いて麻酔幼虫を取り付け、様々な組織における微小球の分布を画像化する。ストック液を作るためには、97.9mLの蒸留水にトリケーヌ粉末400mg、約2.1mLの1M TRISベース(pH9)を混合し、pH7に調整します。この溶液は4°Cで貯えることができる。 トリカインを麻酔薬として使用するには、卵の培地(または所望の培地)の100 mLに4.2 mLのストック溶液を希釈する。この場合、E3 が使用されました。詳細については、参照46 を参照してください。 2. 単細胞の調製および染色 プラスチック製のパスツールピペットを使用してガラス皿に球ステージ胚(4 hpf、受精後時間)を入れます。注入されたビーズのシグナルに陽性であり、mRNA注入の場合に蛍光タンパク質を発現する胚を選択する。一部の胚は、高いビーズクラスタリングを示す可能性があり、除外することができます。 鉗子を使用して胚を手動でデコールする。ガラスパスツールピペットを使用して、約10〜15個の胚を1.5mL反応容器に移します。注:胚がデコールリオネートされるとき、それらはプラスチックに付着し、ガラス製品の使用が必要です。ガラス板の代わりに、1%アガロースの薄層を有するプラスチックペトリ皿を使用することができる。手動デコールリオネーションは、細胞表面タンパク質へのタンパク質分解損傷および機械的細胞および組織特性の潜在的な変化を防ぐために酵素プロナーゼ処理よりも好まれ、回復倍数の延長を防ぐべきである。 E3培地を取り出し、500μLのあらかじめ温められたCO2非依存性組織培養培地(DMEM-F12;L-グルタミンと15mM HEPES、重炭酸ナトリウムおよびフェノールレッドを10単位ペニシリンと10mg/Lストレプトマイシンで補うことなく)を加える。注:顕微鏡インキュベーターを使用しない限り、CO2依存性の培地は使用しないでください。炭酸塩緩衝条件でのRPMIの使用は、培地のpHの変化を引き起こし、細胞生存に影響を与える可能性がある。もう一つの重要な側面は、血清を含む培養培地を避けることです。血清は、リソホスファチジン酸(LPA)、Rho/ROCK経路の強力な活性化剤を含み得る、前駆幹細胞6における細胞収縮性および運動性を制御することができる。核形態や力学12を妨げる可能性のある浸透性の課題を避けるために、媒体の浸透性を300mOsmに維持する必要があります。 チューブを軽く振って細胞の解化を手動で行います。目に大きな塊が見えないとチューブの内容物が濁っていることを確認してください。細胞の損傷と損失を最小限に抑えるために気泡の形成を避けてください。 200 x g で 3 分間遠心分離機。ペレットははっきりと見える必要があります。 上清を取り除き、以下の手順の1つを実行します。 染色が不要な場合は、500 μLのDMEMを追加します。200 μL ピペットで、液体ジェットをペレットにターゲットにして、徐に再懸濁します。細胞に過度のせん断力を加えない。発泡は、細胞の損傷を示します。 HoechstなどのDNA染料で核を標識するには、DMEMの1,000 μLに0.5 μLのDNA-Hoechst(ストック2 mg/mL)を混ぜ、最終濃度の1 μg/mL を得ます。この染色液を500μL加えて細胞に加え、穏やかに再懸濁します。暗闇の中で7分間インキュベートします。 蛍光化学カルシウムインジケーター Calbryte-520 で細胞を染色するには、カルブライト-520を DMEM で 5 μM 濃度に加えます。暗闇の中で20分間インキュベートします。注: 手順 2.5.2 および 2.5.3 で示されているプロトコルは、これらの特定の製品に対して最適化されています。その他の染色は、製造業者が示すプロトコルを使用して行うことができる。 ステップ 2.4 と同じ設定を使用して再び遠心分離機;上清を取り除き、細胞を50μLのDMEMで静かに再懸濁し、懸濁液中のサンプルに対して、または閉じ込め中の細胞の場合は20μLのDMEMを使用します。 3. ポリジメチルシロキサン(PDMS)間隔を用いた光学トラップチャンバの調製 注:光の運動量検出に基づく光力測定では、光トラップ40から出てくるすべての光を捕捉する必要があります。不変量キャリブレーション係数 α (pN/V)のロバスト性については、光力センサの背面焦点面(BFP)での光の分布は、光子の運動量に正確に対応する必要があります。これは、収集レンズの表面から約2mmまでの距離を決定します。 #1.5ガラス底皿のPDMSスピンコーティング。注:約40の料理には、以下のレシピが用意されています。結果として得られるマイクロチャンバは、実験が浮遊細胞または閉じ込められた細胞で行われるかどうかによって異なる高さを有するであろう(図1D)。 50 mL円錐管に9mLのベースポリマーPDMSと1mLのPDMS硬化剤を混合します。2つの製品を積極的に混合して、硬化剤の適切な分布を確保します。 真空ポンプを使用して気泡を避けるために混合物を脱気。真空ボトルに円錐チューブを導入し、チャンバーを避難させる。混合物中に泡が存在しないまで待ちます。注:真空をゆっくりと開けて、PDMSがハヤブサのチューブからこぼれ落ちるのを防ぎます。 スピンコーターチャックにガラス底皿を置きます(図2A)。傷つけたり、指紋を付けたり、皿を汚したりしないように優しくしてください。スピンコーターボックスをアルミニウムホイルでPDMSリークから保護します。 懸濁液中の細胞の実験用のOTチャンバーでは、底皿の中央に約250 μLのPDMS混合物を加え、750 rpmで1分間回転させます。PDMS層の高さは約50μmになります。 狭い細胞の実験用OTチャンバの場合は、PDMS(約50μL)を小さな滴で加え、4,000 rpmで5分間回転させます。PDMS層の高さは約10μmとなります。異なる PDMS の厚さを取得する方法の詳細なプロトコルについては、reference48 を参照してください。 PDMSコーティングされたガラス底の食器を70°Cで1時間硬化させます。 1 x 1 cmの正方形をPDMS層にメスで切り、ピンセットで剥がします(図2C)。閉じ込められた細胞の場合、PDMSの破片をイソプロパノールで洗浄する。 サスペンション中の軽く結合した細胞を用いた実験のためのチャンバーコーティング 0.5 mg/mLでコンカナバリンA(ConA)100 μLを加えて、正方形の空洞の全面を覆い、30分間インキュベートします。注:ConAは細胞表面糖に結合し、カバーガラス表面に個々の細胞を結合するレクチンです。 ConAの落下を取り除き、ConA処理面を傷つけずにDMEM媒体で表面を慎重にすすきます。 ウェルに、以前に用意したサンプル(ステップ2.6)の30 μLを加え、穏やかに再中断して細胞クラスターを取り除きます。 PDMSリムの上に22 x 22 mm #1.5カバーガラスをそっと置いて空洞を閉じます(突然落ちないようにし、可能であれば鉗子を使用してください図2B,C)。注:カバースリップの厚さは、上部のガラスカバーに対して機能します(収集レンズの動作距離は2mm)。 閉じ込められた細胞の実験のためのチャンバーの準備 細胞を含む溶液の10μLの低下(ステップ2.6)を正方形の空洞に入れます(図2B)。 非常に穏やかに、ドロップが全体の領域に広がり、気泡が観察されないような22 x 22ミリメートルカバーガラスでサンプルを挟みます。ここでも、 図2Cに示すように、カバーガラスが突然落下するのを防ぐために、鉗子を使用するのが便利です。 OTチャンバー間隔のための4.代替オプション 注: マイクロファブリケーション ワークショップやスピン コーターがない場合は、これらの手順に従うことができます。 懸濁液中の細胞を用いた実験のためのチャンバー調製注:スピンコーターが使用できない場合、スペーサーは通常の両面スコッチテープ(高さ約100μm)を使用して作ることができます。 中央に約10cm x 10cmの正方形の穴をあけた両面スコッチテープを切ります(PDMSと同じ寸法、 図2B)。 テープの保護層の1つを剥がして取り外し、テープの覆い隠された側面を#1.5 Hガラス底皿の中央に置きます。気泡を避けながら、ガラスに貼り付けたすべての表面を取得し、それを剥がすことによって、テープの残りの保護層を削除するために穏やかに押します。 手順 3.2 の指示に従います。 閉じ込められた細胞の実験のためのチャンバーの準備注意:細胞を正確に閉じ込めるために、既知の直径を持つ単分散微粒子を2つのカバーグラスの間のスペーサーとして使用することができます。 104個のビーズ/μLの濃度で浮遊細胞に10μmのポリスチレンビーズを加えます。 22 x 60 mm のカバーガラスに、細胞とビーズを含む溶液を 10 μL 落とします。 非常に穏やかに、ドロップが全体の領域に広がり、気泡が観察されないような別の22 x 60ミリメートルカバーガラスでサンプルを挟みます。上部カバーガラスを優しく配置するには(突然落ちないように)、鉗子を使用すると便利です。 サンプルは乾燥できるため、迅速に調製を行うことを推奨します。 5. 細胞内測定用の光トラップの設定 注:以下のステップは、アクト光学偏向(AOD)に基づく光学マイクロマニピュレーションモジュールと光運動量変化の直接検出に基づく光学力センサーを備えた商用光ピンセットプラットフォームに最適化されています(図2、参照12,40,49)。セットアップの詳細と光学部品は図2Fにあります。光用トゥイザー操作中の力による変形を観察するために、ニプコウ紡糸盤共焦点顕微鏡を反転顕微鏡の左ポートに結合して、二重色蛍光イメージングを行います。一般性の欠如なし、このプロトコルは、光の運動量検出に基づいて直接力の測定を備えた任意の動的なOTsシステムと適用することができる。インビボアプリケーション50用の自家製光学勾配トラップを構築するための詳細なステップバイステップの手順が利用可能です。AOD変調に基づくものは、複数のトラップと高速測定で最終的な実験のために際立っています51,52。光運動量ベースの器具を構築するためのいくつかのプロトコルが文献36、39、40、53に存在し、他の任意のイメージングモダリティ(差動干渉コントラスト、広視野蛍光など)を採用することができる。 光ピンセットのスタートアップ 出力電力の安定性を最適化するために、実験の30分前に、かなり高い電力(例えば3W)でレーザーをオンにします。 光学マイクロマニピュレーションと力測定ユニットの電子モジュールをオンにします。注:すべてのレーザー安全対策を適用し、機関理事会によって承認された機器のみを使用してください。レーザーがオンのときには、光学顕微鏡の接眼レンズを使用しないでください。承認されたIR保護ゴーグル(950-1080 nm範囲のOD7)を常に使用し、発蛍光ポート2のシャッターでIRレーザー光を遮断し、ステップ5.3の後に光学力センサのアライメントを終了するまで光学トラップソフトウェアを実行しない。一般に、反射性の高いサンプルは、反射が強く、レーザーに損傷を与える可能性があります。 光マイクロマニピュレーションモジュールの入口で、回転HWP(図2F)でトラップパワーを制御します。注: このプロトコルで使用されている商用光マイクロマニピュレーションモジュールには、この機能が既に組み込まれています。自家製の光学トラップシステムでは、より高く、より安定したレーザーパワーを使用できるように、電力制御のためにこのツールを統合します。 空のマイクロチャンバーをキャリブレーションに使用する 1 x 1 cmの正方形を両面スコッチテープに切り、厚さ1mmの顕微鏡スライドに取り付けます。 正方形に水を追加し、#1.5カバーガラス(22 x 22ミリメートル)で上からそれを閉じます。水のわずかに高いボリュームを追加, 例えば, 30-40 μLは、覆われたチャンバー内の泡を避けるためにお勧めします.水がこぼれ落ちる場合は、校正室を静かに拭いてください。 光学力センサのアライメント 60x/1.2の水浸漬目的に水滴を入れます。目的に向けて#1.5カバーガラスをステージ上に置きます。細胞サンプルが最終的になる下面に焦点を当てます。 サンプルを覆う上部ガラススライドの上に浸漬油の液滴を加えます(図2D)。オイルの液滴に接触するまで、力センサーユニットの収集レンズを慎重に下げてください。注:液滴は、トラップから出てくるレーザー光を集めるレンズ全体を覆うほどの大きさでなければなりません。通常、200 μL は表面全体を覆い、安定した浸漬接点を提供するのに十分です。サンプルに漏れる可能性があるため、控えめにして過剰充填を避けてください。 光学力センサーの位置合わせに関する製造元のプロトコルに従って、AT の位置を決める補助カメラのサンプル プレーンイメージを確認します (AUX、図 2F)。非常に穏やかに、フィールド停止(FS、図2F-G)がサンプル平面に結合して現れるまで光学力センサーを下げる。これにより、光運動量変化のサンプル不変検出による適切な直接力測定が確実に行われます。注: FS を十分に閉じて、画像が視野(FOV)よりも小さくなるようにし、表示されます。余分な注意とサンプルに対して光学力センサーの収集レンズを押し込まないでください。光力センサの垂直位置は、BFPでの光の分布の解析から、定義された数値開口(NA)を有する光錐体の分析から決定することができる。 オイルの液滴に気泡がないことを確認します。これらは、力の測定に直接影響を与えることができます。気泡を確認するには、ベルトランレンズを所定の位置に置き(BL、 図2G)、接眼レンズを通るイメージングパスを観察します。汚れや気泡が目に見える場合や、より多くの油が必要な場合(図S1A)、レンズとチャンバーをダストフリーレンズ組織で洗浄し、手順5.3.2と5.3.3で手順を繰り返します。図 S1B に遮るもののない光路が示されています。 光学力センサーのホルダーに置かれた横ねじを使用して、FSをFOVに中央に配置します。精度を高めるには、FS を開いて、補助カメラに表示される FOV をほぼ満たします(AUX、 図 2F)。 6. 光学式トゥイザー最適化 注: 直接力の測定は、閉じ込められたパーティクルに加えられる力から生じる光の運動量の変化のみに依存するため、間接法とは対照的に、トラップの剛性は各実験の前に較正する必要はありません。機器固有の偏向/力係数(α;pN/V,reference41)は、製造業者によって較正されるため、実験不変である。しかし、レーザースポットは70 μm x 70 μmの領域で操作されるため、最適なトラッピングと電力安定性を確保するためには、ステップ6.2~6.5が重要です。以下の手順は、製造ソフトウェアに用意されており、作業領域上での作業領域での作業を半自動で最適化します。 カメラAUX用の、オッツソフトウェアと取得ソフトウェアを起動します。 光ピンセット駆動ソフトウェアのシステムキャリブレーションサブメニューの 「ステップ1:エレクトロニクスオフセット 」ステップをクリックして、初期電圧ベースラインを引きます。 OT作業領域全体でトラップ電力を平坦化するには、HWP をそれに応じて回転させることで、トラップパワーを最大の半分に設定します。レーザー出力を変更してトラップ電力を変更するのではなく、HWPを回転させます(図2F)。 [ステップ 2: 電源 ] をクリックして、トラップ電力のフラット化の自動化ルーチンを開始します。注: これは、OT の作業領域(図 S1D)全体にわたるトラップパワーの変動を補正する重要なステップです。正常なルーチンは、トラップの電力変動を、作業領域の2%に下げ、2分後に収束します。 トラップ位置のキャリブレーションを実行するには、カメラにレーザーからの光が見えるように IR フィルタを取り外します。画像面をマイクロチャンバーの下面に焦点を合わせ、IRスポットを見つけます。カメラAUX取得ソフトウェアで画像プレーン(目標位置)とヒストグラムコントラストを調整することで、可能な限り最小のIRスポットを取得します。必要に応じて、HWPを回転させて光トラップの電力を減らします(図2F)。 [ステップ 3: 自動 ルーチンまたはトラップ位置調整を開始する位置] をクリックします。注: このルーチンは、カメラ AUX の OT の位置座標と AOD ステアリング角度の正確な対応を可能にします。正常に実行されたルーチンは、数秒で角度から位置へのマッピングを生成します。 初期運動量補償注: サンプル全体で光トラップが動くと、BFP での光運動量分布の変動が生じます(図 S1E、F)。これは、トラップパワーがステップ6.3のように平坦化されているにもかかわらず、作業領域上のレーザー位置に関連する力に依存しない信号の変化につながります。その結果、各実験の前に修正する必要がある位置(光学的に閉じ込められたビーズに作用する実際の力とは無関係)による力ベースラインの変動が起きます。 HWPを回転して実験に使用するトラップパワーを設定します(図2F)。 [ツール]サブメニューの [グローバル オフセット ]オプションを クリック します。これにより、最初の運動量ベースラインを修正する光ピンセットソフトウェアの オフセットキャンセル アシスタントが開きます。 オフセット|をクリックします 。補正 して、ポジションバリアント初期運動量を補正します。注: 進行中の週の間に光学路に影響を与える変更がない場合、トラップパワーの平坦化(ステップ6.3)と位置(ステップ6.4)マップは不変のままです。したがって、レーザートラップ経路に影響を与える可能性のある光学要素(二色性ミラー、フィルタなど)の組み合わせを常に使用するか、新しいトラップパワーフラット化ルーチンを実行することをお勧めします。初期運動量補正(ステップ6.5)に関しては、ATプラットフォームのメーカーは、新しいトラッピングパワーと実験セッションごとに変更する必要があるオンザフライキャリブレーションを提供します。ステップ 6.3 および 6.4 は、ステップ 5.2 で説明した空のキャリブレーション・スライドで実行する必要があります。細胞または他のオブジェクトを含むサンプルでは、ステップ6.5は、作業領域の光散乱を変更する可能性のあるオブジェクトを含まないで行われるべきです。 必要に応じて、マイクロスフィアをトラップし、フォース信号を記録しながら、既知の速度でトラップを移動します。たとえば、三角形振動を実行するようにトラップを設定します:記録された力信号は正方形の信号になります。注: ビードに作用するドラッグフォースに従って、力の値は速度に比例して増加するはずです。このテストは、力の測定が正しく行われているという肯定的な制御として役立つ38。あるいは、光学力センサを使用して、光学トラップ剛性、κ[pN/μm]、および位置キャリブレーション係数β[μm/V]をパワースペクトル解析35から得ることができます。正しいアライメントでは、製造元によって提供される不変量キャリブレーション係数はα = κ·β [pN/V]です。 製造元ソフトウェアの[メジャー]サブメニューの[プロット1]をクリックして、リアルタイムの力の読み取りを開始します。これにより、現在の光トラップ力とパワーの読み取りが行われます。 [ツール]サブメニューから[振動パラメータ]ダイアログを開きます。シェイプとタイプのセレクターリングに、それぞれ三角形空間波形を設定します。例として、振幅を10 μm、周波数を3Hzに設定します。これにより、直径1 μm38のマイクロビーズに約1pNの粘性力が生じてしまう。 カメラの AUX ウィンドウで、マイクロビーズを右クリックし、[ 振動の開始] を選択します。力の読み取りは、±1 pNで高原を有する正方形の力信号となる。 マイクロビードを右クリックし、[振動を 停止]を選択します。 7. 回転ディスク共焦点顕微鏡 回転ディスクの共焦点顕微鏡と付属装置、統合レーザーエンジン、および取得カメラをオンにします。 イメージングソフトウェアを起動します。 細胞原形質膜の核およびGFPのHoechst染色のためのイメージングチャネルを設定する。 405 nm および 488 nm の励起レーザーラインをアクティブにします。 マルチバンド二色性を追加して、サンプルに励起を反映し、放出された光をカメラに渡すことができます。 500 nmのロングパスエッジ二色性ミラーで蛍光発光を分割します。 2 台の取得カメラの前に、DAPI/BFP (~445 nm) と GFP (約 521 nm) のエミッション フィルタをそれぞれ使用します。図2F,Gを参照してください。 チャンネルごとに露出時間を 100 ミリ秒に設定します。 レーザー発光を設定して、サンプル平面で5mWのパワーを得ます。電力を測定するには、商用電源メーターを使用します。 イメージング プロトコルを設定します。Hoechst チャンネルから GFP チャネルへのスペクトル ブリードスルーを回避するには、2 つの色素を順次にイメージ化する必要があります。メモ:光トラップのAODとカメラの取得の間にハードウェア同期が存在する場合は、トリガ極性が正しく設定されていることを確認してください。疑わしい場合は、施設管理者または顕微鏡のメーカーに相談してください。 8. 核のインデント実験を行う メモ:力センサーモジュールを持ち上げてサンプルを交換する場合は、ソフトウェアを使用して光トラップをオフにし、起蛍光ポート2のシャッターを閉じます。そうでなければ、光学素子と実験者に深刻な損傷が発生する可能性があります。レンズがステージ/培養皿にぶつからないように、細胞を探すときは、レンズホルダーと底皿の端の間の横方向の距離に注意してください(図2)。 サンプルを顕微鏡に入れ、このプロトコルのステップ 5.3 に従います。 回転HWP(図2F)を用いて、調査した核または細胞内構造の剛性が不明な場合は、トラップパワーを開始値として200mWに設定する。ステップ6.5を通して最初の運動量ベースラインを補うために(顕微鏡段階を使用して)、細胞のない場所に、OTsの作業領域を翻訳します。注: 細胞内構造の剛性に応じて、トラップの電力値を低い値または高い値に調整して、同様のインデント深度を得る必要があります。 顕微鏡ステージソフトウェアコントローラを使用して、透過した明視野顕微鏡を介して1つまたは2つのビーズを持つセルを探します(図3A)。 トラップ軌道を定義します。 [ツール]サブメニューで[軌道]ダイアログを開き、[軌道タイプ]セレクタリングで[変位]を選択します。 数値シートに、後続の各軌道ステップの変位と時間を書き込みます。2つの例を次に示します。 ストレス緩和実験の場合、 図3Bに示すように、プログラム台形荷重。 表S1では、2つの台形のインデントが5μmの移動距離で適用されました。5 μm/sの速度;引き込み前の待ち時間:10 s。 一定速度で反復的なインデント実験を行い、核に時間をかけずに三角ルーチンを取得するには、軌道振幅(例えば、5 μm)とステップの時間(例えば、2.5 μm/秒の速度の場合)を設定します。 表S2では、これは同じ速度で8回適用される。注: これらの値は、各細胞の種類と実験に対して決定する必要がありますが、台形ルーチンの次のパラメータは、ここで示す実験で最も重要なダイナミクスをキャプチャします。待ち時間は、核がインデント後にその完全なストレス緩和を示すために十分でなければなりません 微小球のトラップ 顕微鏡ステージソフトウェアコントローラでビーズの少し上にイメージプレーンを設定します。 「オッツ」ソフトウェアを使用してトラップをアクティブにし、カメラのAUXイメージングウィンドウでビードをクリックします(ステップ6.4に従ってキャリブレーション)。オプティカルトラップによるビードの閉じ込めに成功すると、ビーズの動きが強く低下します。 ビーズを細胞質に向けてクリックアンドドラッグし、核エンベロープから約2μmの距離に置きます(図3A)。ビードのインデントが核膜に対して垂直になるように、軌跡が設定されていることを確認します。 必要に応じて、トラップに対するビードの位置測定に必要な場合は、トラップをスキャンしてトラップ剛性を決定します(k [pN/μm]54、それによりΔxbead = -F/kを参照)。このプロトコルで使用される光マイクロマニピュレーションモジュールには、この目的のための組み込みルーチンがあります。 [ツール]サブメニューで[パーティクル スキャン]ダイアログを開きます。 スキャンするトラップを選択し、スキャン方法として高周波数を選択します。ビードスキャン測定のインデント軌道の方向(xまたはy)を選択します。 トラッピング剛性の測定と共にウィンドウが表示されます。グラフで、2 つのカーソルをドラッグして 、F = -kx に対応する線形トラッピング領域を選択します。選択したデータ部分に線形フィットが自動的に更新されます。注:セル膜から離れたビーズの初期位置(〜5μm)を設定し、中細胞界面での光運動量の偏向が力の測定の適切性に影響を与えます。核が細胞膜に近すぎる場合は、反対側の部位から核をインデントしてみてください。可能でない場合は、セルを破棄します。 イメージングソフトウェアの取得ボタンをクリックして、画像取得を開始します。 [データ|をクリックして、トラップ位置を開始し、測定データを強制的に保存リアルタイムの強制読み取りウィンドウ(ステップ6.6.1のように開いた)に保存します。メモ:光トラップには、カメラのタイミング出力に接続できるトリガ入力が装備されています。したがって、画像データと力データはハードウェア同期化され、電子は取得中の画像のフレーム数とトラップサイクルをマッピングすることができる。 以前にロードした軌道を開始するには、ビードを右クリックし、[ 軌道を開始]を選択します。 軌道が終了し、システムが安定するまで待ちます。 トラップ力測定データ保存を停止します。データ保存ダイアログがポップアップ表示されます。注: データストレージを最適化するには、このダイアログボックスでデシメーションパラメータ(10、100、または1000)を選択して、データをデシメーションすることができます。 画像の取得を停止し、ユーザーの選択の後処理ソフトウェアで結果をプロットします。 ルーチン中に微小球が失われ、核をインデントできない場合(図S2)、測定を破棄してパワーを上げます。手順 6.5 を繰り返す必要があることに注意してください。私たちの手では、ルーチンの少なくとも95%がトラップからビーズを失うことなく正常に完了しています。