Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Tutti i protocolli utilizzati sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Ethic Committee (PRBB-IACUEC) e implementati secondo le normative nazionali ed europee. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i principi delle 3R. I pesci zebra (Danio rerio) sono stati mantenuti come descritto in precedenza. 1. Preparazione di cellule staminali progenitrici embrionali embrionali primarie isolate Preparazione di micropipette e agarosioNOTA: per un protocollo completo di microiniezione di embrioni di zebrafish, vedere riferimento45. Con un estrattore di micropipette, tirare un capillare di vetro da 1,0 mm per ottenere due aghi45. Conservare gli aghi inutilizzati in una capsula di Petri da 150 mm attaccata a un cuscino di pasta da gioco o in un anello di nastro da laboratorio interno-esterno per proteggere la punta sottile da danni durante il trasporto. Fondere l’agarosio ultrapuro all’1% in E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) in una cucina standard / forno a microonde da laboratorio per 10 s. Riscaldare ripetutamente la miscela per brevi periodi di tempo (pochi secondi) fino a quando l’agarosio si scioglie. Quando l’agarosio è completamente sciolto, lasciarlo raffreddare brevemente, quindi versarlo in una capsula di Petri di 10 cm. Aggiungere lentamente lo stampo triangolare per microiniezione (vedi Tabella dei materiali) sulla parte superiore dell’agarosio evitando la comparsa di bolle. Non spingere lo stampo, assicurandosi che rimanga sulla superficie dell’agarosio. Quando l’agarosio si solidifica completamente, rimuovere lo stampo triangolare molto lentamente esercitando una forza delicata per evitare eventuali rotture nell’agarosio. La piastra può essere conservata a testa in giù a 4 °C per 2-4 settimane. 30 minuti prima della microiniezione, estrarre la piastra dal frigorifero e aggiungere E3 preriscaldato a 28 °C per farlo stabilizzare a temperatura ambiente. Preparazione della miscela di iniezione Per preparare la miscela di iniezione, diluire microsfere da 1 μm (polistirene, non fluorescente) in rapporto 1:5 in acqua priva di RNasi. Preparare l’mRNA per l’espressione transitoria di marcatori fluorescenti o l’espressione di costrutti genici ricombinanti e/o la co-iniezione di morfolino alla concentrazione desiderata.NOTA: Una tipica miscela di iniezione per la co-iniezione di microsfere insieme a 100 pg di mRNA per embrione da etichettare, ad esempio, il nucleo con H2A-mCherry è: 1 μL di perline + 1 μL di mRNA (la concentrazione di stock è 1 μg/μL) + 2,5 μL di acqua priva di RNA + 0,5 μL di rosso fenolo (soluzione madre 0,5%, il rosso fenolo non è obbligatorio; viene utilizzato per una migliore visualizzazione della goccia iniettata ma l’iniezione non marcata drop è visibile anche per uno sperimentatore esperto). L’iniezione di RNA può anche essere utile per selezionare embrioni iniettati. Le microsfere fluorescenti possono essere iniettate, invece che non fluorescenti, per visualizzarle. Caricamento e calibrazione dell’ago per microiniezione Accendere il microiniettore utilizzando l’opzione Time-Gated . Questa impostazione è molto importante per calibrare correttamente il volume di iniezione. Impostare il tempo di gating a circa 500 ms. Caricare 3 μL della miscela di iniezione nell’ago utilizzando una pipetta micro-caricatore. Inserire l’ago nel micromanipolatore e sigillare ermeticamente. Controllare se il micromanipolatore è in una buona posizione e ha abbastanza libertà per muoversi in direzione x-y sulla piastra di iniezione. Misurare la dimensione della goccia utilizzando un vetrino micrometrico (divisioni 5 mm/100) con una goccia di olio minerale in cima45 ed espellendo una goccia della miscela di iniezione direttamente nell’olio minerale. Ritaglia l’ago con una pinza affilata ad un angolo ripido per generare una punta appuntita affilata. Regolare la dimensione della goccia a 0,1 mm, corrispondente a 0,5 nL di materiale iniettato.NOTA: Se tagliando l’ago si supera questo volume, si consiglia di ripetere la procedura di calibrazione con un nuovo ago. Il tempo di gating del microiniettore può essere leggermente regolato per adattarsi al volume della goccia; tuttavia, brevi tempi di gating corrispondono a un grande diametro dell’ago, che potenzialmente danneggia gli embrioni. Microiniezione di embrioni di zebrafish allo stadio di una cellula Raccogliere embrioni di zebrafish poco dopo la fecondazione per la microiniezione della miscela di perline direttamente nell’embrione allo stadio unicellulare (zigote) prima che si verifichi la prima divisione cellulare.NOTA: Ciò garantisce una corretta distribuzione delle microsfere e una resa sufficientemente elevata di blastomeri isolati con almeno una microsfera per cellula nelle fasi successive dello sviluppo in cui vengono eseguiti esperimenti (stadio blastula-gastrula). Gli esperimenti di indentazione possono ancora essere eseguiti se ci sono due sfere all’interno della cellula, ma le cellule che non hanno perline dovrebbero essere escluse (anche se è possibile la rientranza senza sfere). In questo protocollo sono stati utilizzati ceppi wildtype AB, ma è possibile utilizzare qualsiasi altro ceppo, ad esempio TL. Posizionare embrioni allo stadio unicellulare (zigote) in uno stampo di agarosio all’1% di forma triangolare preriscaldata, come mostrato nella Figura 1A, utilizzando una pipetta pasteur di plastica. Rimuovere il mezzo extra con la stessa pipetta per evitare che gli embrioni galleggino intorno. Spingere delicatamente gli embrioni nello stampo triangolare tramite un pennello. Mantenere un po’ di spazio tra gli embrioni per facilitare il corretto orientamento (Figura 1B). Allineare delicatamente gli embrioni con un pennello in modo che gli embrioni siano orientati lateralmente, con l’unica cellula dello zigote chiaramente visibile, come mostrato nella Figura 1B. Un orientamento ideale per la microiniezione si raggiunge quando l’unica cellula dell’embrione è rivolta verso la direzione dell’ago ( iniezione attraverso il polo animale dell’embrione) o in modo opposto di fronte alla cellula del tuorlo ( iniezione attraverso il polo vegetale dell’embrione), come mostrato nella Figura 1C. Tenere il piatto con una mano e usare l’altra mano per posizionare la punta dell’ago utilizzando il controller del micromanipolatore. Abbassare la punta dell’ago verso gli embrioni. Perforare il corion ed entrare nell’embrione unicellulare con l’ago mentre si monitora la procedura attraverso lo stereomicroscopio. Garantire il corretto posizionamento dell’ago e, dopo l’iniezione, la corretta posizione della goccia iniettata come mostrato nella Figura 1C. Ripeti per tutti gli embrioni: sposta l’ago verso l’alto, fai scorrere il piatto con gli embrioni fino a quando l’embrione successivo è centrato, abbassa l’ago e iniettalo. Una volta iniettato l’intero set di embrioni, rimuovere gli embrioni dalla muffa di agarosio / capsula di Petri lavando un po ‘di E3 e metterli in una nuova capsula di Petri usando una pipetta di plastica Pasteur. Si raccomanda di posizionare mezzi sufficienti sulla piastra di iniezione per evitare l’essiccazione degli embrioni durante la procedura di microiniezione. Ripetere la procedura fino a quando non viene iniettato il numero desiderato di embrioni. Gli embrioni devono essere in uno stadio cellulare per garantire la diffusione massima e omogenea delle perline.NOTA: Questa procedura è ottimizzata per gli embrioni precoci di blastula e probabilmente deve essere ottimizzata se si devono studiare diversi stadi di sviluppo. Posizionare gli embrioni iniettati all’interno di un incubatore a 28-31 °C per circa 4 ore o fino allo stadio desiderato (Figura 1D) prima di procedere con il protocollo per la coltura cellulare primaria.NOTA: Facoltativamente, lasciare che gli embrioni si sviluppino oltre lo stadio di blastula (o il punto temporale di misurazione desiderato) per garantire la sopravvivenza ed escludere artefatti tossici. Negli stadi larvali, montare larve anestetizzate con tricaina in agarosio allo 0,75% e visualizzare la distribuzione delle microsfere in vari tessuti. Per ottenere una soluzione madre, mescolare: 400 mg di polvere di tricaina in 97,9 mL di acqua distillata, circa 2,1 mL di 1 M TRIS-base (pH 9) e regolare a pH 7. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C. Per utilizzare la tricaina come anestetico, diluire 4,2 mL di soluzione madre in 100 mL di terreno dell’uovo (o mezzo desiderato); in questo caso, è stato utilizzato l’E3. Consultare reference46 per i dettagli. 2. Preparazione e colorazione unicellulare Posizionare gli embrioni dello stadio della sfera (4 hpf, ore dopo la fecondazione) in un piatto di vetro usando una pipetta pasteur di plastica. Selezionare gli embrioni che sono positivi per il segnale delle perle iniettate e che esprimono la proteina fluorescente in caso di iniezione di mRNA. Alcuni embrioni potrebbero mostrare un elevato raggruppamento di perline e possono essere esclusi. Decorionare manualmente gli embrioni usando una pinza. Trasferire circa 10-15 embrioni in contenitori di reazione da 1,5 ml utilizzando una pipetta pasteur di vetro.NOTA: Quando gli embrioni sono deconizionati, si attaccano alla plastica ed è richiesto l’uso di oggetti in vetro. In alternativa alla lastra di vetro, è possibile utilizzare una piastra di Petri in plastica con uno strato sottile di agarosio all’1%. La decorionazione manuale deve essere preferita al trattamento enzimatico con pronasi per prevenire danni proteolitici alle proteine della superficie cellulare e potenziali cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle cellule e dei tessuti, prevenendo tempi di recupero prolungati47. Rimuovere il mezzo E3 e aggiungere 500 μL di terreno di coltura tissutale preriscaldato co2-indipendente (DMEM-F12; con L-glutammina e 15 mM HEPES, senza bicarbonato di sodio e rosso fenolo integrato con 10 unità di penicillina e 10 mg/ L di streptomicina).NOTA: non utilizzare mezzi dipendenti dalla CO2 a meno che non si utilizzi un incubatore per microscopio. L’uso di, ad esempio, RPMI in condizioni tamponate con carbonato causa cambiamenti nel pH del mezzo e può influenzare la sopravvivenza cellulare. Un altro aspetto chiave è quello di evitare i terreni di coltura che contengono siero. Il siero può contenere acido lisofosfatidico (LPA), un potente attivatore della via Rho/ROCK, in grado di controllare la contrattilità cellulare e la motilità nelle cellule staminali progenitrici6. L’osmolarità del mezzo dovrebbe essere mantenuta a 300 mOsm per evitare sfide osmotiche che potrebbero interferire con la morfologia o la meccanica nucleare12. Dissociare manualmente le cellule scuotendo delicatamente il tubo. Assicurarsi che il contenuto del tubo diventi torbido senza grossi pezzi visibili dall’occhio. Evitare la formazione di bolle per ridurre al minimo il danno e la perdita di cellule. Centrifuga a 200 x g per 3 min. Il pellet deve essere chiaramente visibile. Rimuovere il surnatante e seguire uno dei passaggi descritti di seguito. Se non è necessaria alcuna colorazione, aggiungere 500 μL di DMEM. Risospendare delicatamente con una pipetta da 200 μL puntando un getto liquido sul pellet. Non esercitare un’eccessiva forza di taglio sulle cellule. La formazione di schiuma indica danni alle cellule. Per etichettare il nucleo con coloranti a DNA come Hoechst, mescolare 0,5 μL di DNA-Hoechst (stock 2 mg/mL) in 1.000 μL di DMEM per ottenere 1 μg/mL di concentrazione finale. Aggiungere 500 μL di questa soluzione colorante alle cellule e risospensare delicatamente. Incubare per 7 minuti al buio. Per macchiare le cellule con un indicatore chimico fluorescente di calcio Calbryte-520, aggiungere Calbryte-520 a una concentrazione di 5 μM in DMEM. Incubare per 20 minuti al buio.NOTA: I protocolli indicati nei passaggi 2.5.2 e 2.5.3 sono stati ottimizzati per questi prodotti specifici. Altre colorazioni possono essere eseguite utilizzando i protocolli indicati dal produttore. Centrifugare di nuovo utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 2.4; rimuovere il surnatante e risospescere delicatamente le cellule (per evitare la formazione di cluster) in 50 μL di DMEM per i campioni in sospensione o 20 μL di DMEM per le cellule in confinamento. 3. Preparazione di camere di intrappolamento ottico utilizzando la spaziatura tra polidimetilsilossano (PDMS) NOTA: le misurazioni della forza ottica basate sul rilevamento del momento luminoso richiedono la cattura di tutta la luce che emerge dalle trappole ottiche40. Affinché la robustezza del fattore di calibrazione invariante α (pN/V), la distribuzione della luce sul piano focale posteriore (BFP) del sensore di forza ottica deve avere una corrispondenza accurata con il momento fotonico. Questo determina la distanza dalla superficie della lente di raccolta al piano di intrappolamento a circa 2 mm, che è l’altezza massima delle camere di intrappolamento ottico. Rivestimento PDMS di piatti con fondo di vetro #1.5.NOTA: La seguente ricetta è prevista per circa 40 piatti. La microcamera risultante avrà altezze diverse a seconda che gli esperimenti debbano essere condotti su cellule sospese o confinate (Figura 1D). Miscelare 9 mL del polimero di base PDMS e 1 mL di agente polimerizzante PDMS in un tubo conico da 50 mL. Mescolare attivamente i due prodotti per garantire una corretta distribuzione dell’agente polimerizzante. Degassare la miscela per evitare bolle utilizzando una pompa per vuoto. Introdurre il tubo conico in una bottiglia sottovuoto ed evacuare la camera. Attendere che non siano presenti bolle nella miscela.NOTA: Aprire lentamente il vuoto per evitare schiuma e fuoriuscite del PDMS dal tubo del falco. Posizionare il piatto con fondo di vetro sul mandrino dello spin-coater (Figura 2A). Sii gentile per non graffiare, prendere le impronte digitali o sporcare il piatto. Proteggere la scatola di spin-coater da perdite PDMS con un foglio di alluminio. Per le camere OT per esperimenti su celle in sospensione, aggiungere circa 250 μL di miscela PDMS al centro del piatto inferiore e ruotarla a 750 giri / min per 1 minuto. L’altezza dello strato PDMS sarà di circa 50 μm48. Per le camere OT per esperimenti su celle confinate, aggiungere una piccola goccia di PDMS (circa 50 μL) e ruotarla a 4.000 giri / min per 5 minuti. L’altezza dello strato PDMS sarà di circa 10 μm. Per un protocollo dettagliato su come ottenere diversi spessori PDMS, vedere reference48. Polimerizzare le piastre con fondo di vetro rivestite PDMS a 70 °C per 1 ora. Tagliare un quadrato di 1 x 1 cm sullo strato PDMS con un bisturi e staccarlo con una pinzetta (Figura 2C). Nel caso di celle confinate, lavare i detriti PDMS con isopropanolo. Rivestimento della camera per esperimenti con celle leggermente attaccate in sospensione Aggiungere 100 μL di Concanavalina A (ConA) a 0,5 mg/mL per coprire l’intera superficie della cavità quadrata e lasciarla incubare per 30 min.NOTA: ConA è una lectina che si lega agli zuccheri della superficie cellulare e accoppia le singole cellule sulla superficie del vetro di copertura. Rimuovere la goccia di ConA e risciacquare accuratamente la superficie con il mezzo DMEM senza graffiare la superficie trattata conA. Aggiungere 30 μL del campione precedentemente preparato (fase 2.6) nel pozzetto e risospesci delicatamente per eliminare eventuali cluster cellulari. Chiudere la cavità posizionando delicatamente un vetro di copertura #1.5 da 22 x 22 mm sopra i cerchi PDMS (evitare di lasciarlo cadere bruscamente, utilizzare una pinza se possibile, Figura 2B,C).NOTA: qualsiasi spessore di copertura funzionerebbe per la copertura superiore in vetro (la lente di raccolta ha una distanza di lavoro di 2 mm). Preparazione della camera per esperimenti con cellule in confinamento Introdurre una goccia di 10 μL di soluzione contenente cellule (fase 2.6) nella cavità quadrata (Figura 2B). Molto delicatamente, inserire il campione con un vetro di copertura 22 x 22 mm in modo tale che la goccia si diffonda in tutta l’area e non si osservino bolle. Ancora una volta, è conveniente usare una pinza, come mostrato nella Figura 2C, per evitare che il vetro di copertura cada bruscamente. 4. Opzioni alternative per la spaziatura della camera OT NOTA: questi passaggi possono essere seguiti se non è disponibile un’officina di microfabbricazione o una centrifuga. Preparazione della camera per esperimenti con cellule in sospensioneNOTA: Nel caso in cui non sia disponibile uno spin coater, è possibile realizzare un distanziatore utilizzando un normale scotch biadesivo (circa 100 μm di altezza). Tagliare un pezzo di scotch biadesivo con un foro quadrato di circa 10 cm x 10 cm al centro (stesse dimensioni del PDMS, Figura 2B). Rimuovere uno degli strati protettivi del nastro staccandolo e posizionare il lato scoperto del nastro al centro di un piatto con fondo di vetro #1.5 H. Premere delicatamente per far aderire tutta la superficie al vetro evitando bolle d’aria, quindi rimuovere lo strato protettivo rimanente del nastro staccandolo. Seguire le istruzioni nel passaggio 3.2. Preparazione della camera per esperimenti con cellule in confinamentoNOTA: Per confinare con precisione le cellule, le microparticelle monodisperse con un diametro noto possono essere utilizzate come distanziatori tra i due vetri di copertura. Aggiungere 10 μm di perle di polistirene alle cellule sospese ad una concentrazione di 104 perline/μL. Mettere una goccia di 10 μL di soluzione contenente celle e perline su un vetro di copertura di 22 x 60 mm. Molto delicatamente, inserire il campione con un altro vetro di copertura 22 x 60 mm in modo tale che la goccia si diffonda in tutta l’area e non si osservino bolle. Per posizionare delicatamente il vetro di copertura superiore (evitare che cada bruscamente), è conveniente usare una pinza. Poiché il campione può asciugarsi, si consiglia di eseguire rapidamente la preparazione. 5. Impostazione della trappola ottica per le misurazioni intracellulari NOTA: i seguenti passaggi sono ottimizzati per una piattaforma commerciale di pinzette ottiche comprendente un modulo di micromanipolazione ottica basato sulla deflessione acusto-ottica (AOD) e un sensore di forza ottica basato sul rilevamento diretto delle variazioni del momento luminoso (Figura 2, riferimento12,40,49). I dettagli e i componenti ottici del set-up sono riportati nella Figura 2F. Per osservare la deformazione indotta dalla forza durante le manipolazioni ottiche della pinzetta, un microscopio confocale a disco rotante Nipkow è accoppiato alla porta sinistra del microscopio invertito per l’imaging a fluorescenza a doppio colore. Senza la mancanza di generalità, questo protocollo può essere applicato con qualsiasi sistema OT dinamico dotato di misurazioni della forza diretta basate sul rilevamento del momento leggero. Sono disponibili procedure dettagliate passo-passo per costruire trappole a gradiente ottico costruite in casa per applicazioni in vivo50. Quelli basati sulla modulazione AOD si distinguono per eventuali esperimenti con trappole multiple e misurazioni veloci51,52. Esistono diversi protocolli per costruire uno strumento basato sul momento luminoso36,39,40,53 e qualsiasi altra modalità di imaging (contrasto di interferenza differenziale, fluorescenza a campo largo, ecc.) può essere impiegata. Avviamento pinzette ottiche Al fine di ottimizzare la stabilità della potenza di uscita, accendere il laser a una potenza considerevolmente elevata (ad esempio, 3 W) almeno 30 minuti prima dell’esperimento. Accendere il modulo elettronico della micromanipolazione ottica e delle unità di misurazione della forza.NOTA: Applicare tutte le misure di sicurezza laser e utilizzare solo apparecchiature approvate dal consiglio istituzionale. Non utilizzare mai gli oculari del microscopio ottico quando il laser è acceso. Utilizzare sempre occhiali di protezione IR approvati (OD7 nell’intervallo 950-1080 nm), bloccare la luce laser IR con l’otturatore nella porta di epifluorescenza 2 e non eseguire il software di intrappolamento ottico fino a quando non si completa l’allineamento del sensore di forza ottica dopo il passaggio 5.3. In generale, non utilizzare un campione altamente riflettente, poiché la retroriflessione potrebbe causare danni al laser. Controllare la potenza della trappola con l’HWP rotante (Figura 2F) all’ingresso del modulo di micromanipolazione ottica.NOTA: il modulo di micromanipolazione ottica commerciale utilizzato in questo protocollo incorpora già questa funzione. Per i sistemi di intrappolamento ottico costruiti in casa, integrare questo strumento per il controllo dell’alimentazione in modo da poter utilizzare potenze laser più elevate e più stabili. Utilizzare una microcamera vuota per la calibrazione Tagliare un quadrato di 1 x 1 cm su uno scotch biadesivo e fissarlo su un vetrino per microscopio di 1 mm di spessore. Aggiungere acqua nel quadrato e chiuderlo dall’alto con un vetro di copertura #1,5 (22 x 22 mm). Si consiglia di aggiungere un volume leggermente superiore di acqua, ad esempio 30-40 μL per evitare bolle all’interno della camera coperta. Pulire delicatamente la camera di calibrazione in caso di fuoriuscita di acqua. Allineamento del sensore ottico di forza Metti una goccia d’acqua sull’obiettivo di immersione in acqua 60x/1.2. Posizionare la camera di calibrazione sul palco con il vetro di copertura #1.5 rivolto verso l’obiettivo. Concentrati sulla superficie inferiore, dove alla fine si troveranno i campioni di cellule. Aggiungere una goccia di olio per immersione sopra il vetrino superiore che copre il campione (Figura 2D). Abbassare attentamente la lente di raccolta dell’unità sensore di forza fino a quando non contatta la goccia d’olio.NOTA: la goccia deve essere abbastanza grande da coprire l’intera lente che raccoglie la luce laser che emerge dalle trappole. Di solito, 200 μL sono sufficienti per coprire l’intera superficie e fornire un contatto di immersione stabile. Sii prudente ed evita il riempimento eccessivo in quanto potrebbe fuoriuscire nel campione. Seguendo il protocollo del produttore per l’allineamento del sensore di forza ottica, guardare l’immagine del piano campione sulla fotocamera ausiliaria che verrà utilizzata per posizionare gli OT (AUX, Figura 2F). Molto delicatamente, abbassare il sensore di forza ottica fino a quando l’arresto del campo (FS, Figura 2F-G) appare coniugato sul piano del campione. Ciò garantirà adeguate misurazioni della forza diretta dal rilevamento invariante del campione delle variazioni del momento luminoso40.NOTA: chiudere fs abbastanza in modo che la sua immagine diventi più piccola del campo visivo (FOV), quindi visibile. Prestare particolare attenzione e non spingere la lente di raccolta del sensore di forza ottica contro il campione. La posizione verticale del sensore di forza ottica può in alternativa essere determinata dall’analisi della distribuzione della luce di intrappolamento al BFP per i coni di luce con apertura numerica definita (NA). Assicurarsi che non ci siano bolle d’aria nella goccia d’olio; questi possono influenzare direttamente le misurazioni della forza. Per verificare la presenza di bolle d’aria, posizionare la lente di Bertrand (BL, Figura 2G) e osservare il percorso di imaging attraverso l’oculare. Se sono visibili sporcizia o bolle d’aria o è necessario più olio (Figura S1A), pulire la lente e la camera con tessuto privo di polvere e ripetere la procedura nei passaggi 5.3.2 e 5.3.3. Un percorso ottico senza ostacoli è illustrato nella Figura S1B. Utilizzando le viti laterali posizionate sul supporto del sensore di forza ottica, centrare l’FS nel FOV. Per una maggiore precisione, aprire l’FS in modo che riempia quasi il FOV visibile sulla telecamera ausiliaria (AUX, Figura 2F). 6. Ottimizzazione della pinzetta ottica NOTA: La misurazione della forza diretta si basa esclusivamente sul cambiamento del momento luminoso derivante dalla forza esercitata sulla particella intrappolata e quindi, a differenza dei metodi indiretti, la rigidità della trappola non deve essere calibrata prima di ogni esperimento. La conversione specifica dello strumento del fattore di deflessione/forza (α; pN/V, riferimento41) è calibrata dal produttore ed è quindi invariante sperimentale. Tuttavia, poiché lo spot laser viene manipolato su un’area di 70 μm x 70 μm, i passaggi da 6,2 a 6,5 sono fondamentali per garantire un intrappolamento ottimale e la stabilità di potenza. I seguenti passaggi sono forniti nel software del produttore in modo che gli OT vengano ottimizzati sull’area di lavoro in modo semi-automatico. Avviare il software OT e il software di acquisizione per fotocamera AUX. Sottrarre la linea di base della tensione iniziale facendo clic sul passaggio Passaggio 1: Offset elettronico nel sottomenu Calibrazione sistema del software di guida delle pinzette ottiche. Per eseguire l’appiattimento della potenza di trappola nell’area di lavoro OT, impostare la potenza della trappola a metà del suo massimo ruotando di conseguenza l’HWP. Non modificare la potenza della trappola cambiando l’uscita laser, ma con l’HWP rotante (Figura 2F). Fare clic su Passaggio 2: Avviare la routine automatizzata per l’appiattimento dell’alimentazione della trappola.NOTA: questo è un passaggio fondamentale per compensare la variazione della potenza della trappola nell’area di lavoro degli OT (Figura S1D). Una routine di successo porta la variazione della potenza della trappola al 2% nell’area di lavoro degli OT e converge dopo 2 minuti. Per eseguire la calibrazione della posizione della trappola, rimuovere il filtro IR in modo che la luce del laser sia visibile sulla fotocamera. Individuate il punto IR impostando il piano dell’immagine focalizzato sulla superficie inferiore della microcamera. Ottieni il punto IR più piccolo possibile regolando il piano dell’immagine (posizione dell’obiettivo) e il contrasto dell’istogramma nel software di acquisizione AUX della fotocamera. Se necessario, ridurre la potenza della trappola ottica ruotando l’HWP (Figura 2F). Fare clic su Passaggio 3: Posizione per avviare la calibrazione automatica della routine o del posizionamento dell’intrappola.NOTA: questa routine consente la corrispondenza precisa delle coordinate di posizione dell’OT nell’AUX della telecamera con gli angoli di sterzata AOD. Una routine di successo genera la mappatura angolo-posizione in pochi secondi. Compensazione iniziale del momentumNOTA: il movimento della trappola ottica attraverso il campione provoca variazioni nella distribuzione del momento luminoso alla BFP (Figura S1E, F). Ciò porta a cambiamenti di segnale indipendenti dalla forza relativi alla posizione del laser sull’area di lavoro, anche se la potenza della trappola è stata appiattita come nel passaggio 6.3. La conseguenza è una variazione della forza basale dovuta alla posizione (indipendente da una forza effettiva che agisce sul tallone intrappolato otticamente) che deve essere corretta prima di ogni esperimento. Impostare la potenza trappola che verrà utilizzata negli esperimenti, ruotando l’HWP (Figura 2F). Fate clic sull’opzione Offset globale (Global Offset ) nel sottomenu Strumenti (Tools ). Verrà aperto l’assistente Offset Cancel del software delle pinzette ottiche che corregge la linea di base del momentum iniziale. Fate clic su Offset | Compensare per correggere il momentum iniziale della variante di posizione.NOTA: se nessuna modifica influisce sul percorso ottico durante le settimane in corso, le mappe di appiattimento della potenza della trappola (passaggio 6.3) e di posizione (passaggio 6.4) rimarranno invarianti. Raccomandiamo quindi di utilizzare sempre la stessa combinazione di elementi ottici (specchi dicroici, filtri, ecc.) che possono influenzare il percorso della trappola laser o di eseguire una nuova routine di appiattimento della potenza della trappola. Per quanto riguarda la compensazione del momento iniziale (fase 6.5), il produttore della piattaforma OT fornisce una calibrazione al volo che deve essere modificata per ogni nuova potenza di intrappolamento e sessione sperimentale. Le fasi 6.3 e 6.4 devono essere eseguite sul vetrino di taratura vuoto descritto al punto 5.2. In un campione contenente cellule o altri oggetti, il passaggio 6.5 deve essere effettuato privo di oggetti che possano alterare la diffusione della luce nell’area di lavoro degli OT. Facoltativamente, intrappolare una microsfera e spostare la trappola a una velocità nota durante la registrazione del segnale di forza. Ad esempio, impostare la trappola per eseguire un’oscillazione triangolare: il segnale di forza registrato sarà un segnale quadrato.NOTA: il valore della forza deve aumentare linearmente con la velocità, in base alla forza di trascinamento che agisce sul tallone. Questo test serve come controllo positivo che le misurazioni della forza vengano eseguite correttamente38. In alternativa, il sensore di forza ottica può essere utilizzato per ottenere la rigidità di intrappolamento ottico, κ [pN/μm], e il fattore di calibrazione della posizione, β [μm/V], dall’analisi spettrale di potenza35. Con un corretto allineamento, il fattore di calibrazione invariante fornito dal produttore è α = κ·β [pN/V]. Avviare una lettura della forza in tempo reale facendo clic su Plot 1 nel sottomenu Misure nel software del produttore. Ciò fornirà una lettura dell’attuale forza e potenza di intrappolamento ottico. Aprite la finestra di dialogo Parametri oscillazione dal sottomenu Strumenti . Impostate una forma d’onda a spazio triangolare rispettivamente negli anelli di selezione Forma (Shape) e Tipo (Type). Ad esempio, impostare un’ampiezza di 10 μm e una frequenza di 3 Hz. Ciò si tradurrà in una forza viscosa di circa 1 pN su una microperla con un diametro di 1 μm38. Nella finestra AUX della fotocamera, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla microperla e selezionare Avvia oscillazione. La lettura della forza diventerà un segnale di forza quadrato con plateau a ±1 pN. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla microperla e selezionare Interrompi oscillazione. 7. Microscopia confocale a disco rotante Accendere il microscopio confocale a disco rotante e le apparecchiature accessorie, i motori laser integrati e le telecamere di acquisizione. Avviare il software di imaging. Impostare i canali di imaging per la colorazione Hoechst del nucleo e GFP per la membrana plasmatica cellulare. Attivare le linee laser di eccitazione a 405 nm e 488 nm. Aggiungere un dicroico multibanda per riflettere l’eccitazione al campione e che consenta alla luce emessa di passare alle telecamere. Dividere l’emissione di fluorescenza con uno specchio dicroico a bordo passante lungo 500 nm. Utilizzare i filtri di emissione DAPI/BFP (~445 nm) e GFP (~521 nm) rispettivamente davanti alle due telecamere di acquisizione. Fare riferimento alla Figura 2F,G. Impostare il tempo di esposizione su 100 ms per ogni canale. Impostare l’emissione laser per ottenere una potenza di 5 mW sul piano del campione. Per misurare la potenza, utilizzare un misuratore di potenza commerciale. Impostare il protocollo di imaging. Per evitare il sanguinamento spettrale dal canale Hoechst al canale GFP, i due coloranti devono essere ripresi in sequenza.NOTA: se esiste una sincronizzazione hardware tra gli AOD della trappola ottica e l’acquisizione della fotocamera, assicurarsi che la polarità del trigger sia impostata correttamente. In caso di dubbio, consultare il responsabile della struttura o il produttore del microscopio. 8. Esecuzione degli esperimenti di indentazione del nucleo NOTA: Spegnere sempre le trappole ottiche, sia utilizzando il software che chiudendo l’otturatore sulla porta di epifluorescenza 2, quando si solleva il modulo del sensore di forza e si cambia il campione. In caso contrario, potrebbero verificarsi gravi danni agli elementi ottici e allo sperimentatore. Prestare attenzione alla distanza laterale tra il supporto della lente e il bordo inferiore della parabola quando si cercano le celle per evitare di urtare la lente nel piatto di fase/ coltura (Figura 2). Posizionare il campione al microscopio e seguire il passaggio 5.3 di questo protocollo. Utilizzando l’HWP rotante (Figura 2F), impostare la potenza della trappola a 200 mW come valore di partenza se la rigidità del nucleo o della struttura intracellulare studiata non è nota. Tradurre l’area di lavoro degli OT (utilizzando lo stadio del microscopio) in un luogo privo di cellule per compensare la linea di base del momento iniziale fino al passaggio 6.5.NOTA: a seconda della rigidità della struttura subcellulare, il valore della potenza della trappola deve essere regolato su valori inferiori o superiori per ottenere una profondità di rientro simile. Utilizzando il controller software dello stadio del microscopio, cercare una cella con una o due perline attraverso la microscopia a campo luminoso trasmessa (Figura 3A). Definite una traiettoria trappola. Aprite la finestra di dialogo Traiettoria nel sottomenu Strumenti (Tools ) e scegliete Spostamento (Displacement) nell’anello del selettore Tipo traiettoria (Trajectory Type ). Nel foglio numerico, scrivi lo spostamento e il tempo di ogni passo successivo della traiettoria. Ecco due esempi. Per un esperimento di rilassamento dello stress, programmare carichi trapezoidali, come mostrato nella Figura 3B. Nella tabella S1 sono state applicate due rientranze trapezoidali con una distanza di viaggio di 5 μm; velocità di 5 μm/s; tempo di attesa prima della ritrattazione: 10 s. Per un esperimento di rientranza ripetitiva a velocità costante per ottenere una routine triangolare senza tempo di permanenza sul nucleo, impostare l’ampiezza della traiettoria, ad esempio 5 μm, e il tempo per il passo, ad esempio, 2 s per una velocità di 2,5 μm/s. Nella tabella S2, questo viene applicato otto volte alla stessa velocità.NOTA: Questi valori devono essere determinati per ogni tipo di cellula ed esperimento, ma i seguenti parametri di una routine trapezoidale catturano le dinamiche più importanti nell’esperimento qui presentato. Il tempo di attesa dovrebbe essere sufficiente affinché il nucleo mostri il suo completo rilassamento da stress dopo l’indentazione Intrappolamento di una microsfera Impostare il piano dell’immagine leggermente sopra il tallone con il controller software dello stadio del microscopio. Attivare le trappole utilizzando il software OTs e fare clic sul tallone nella finestra di imaging AUX della fotocamera (calibrato dopo il passaggio 6.4). Il confinamento riuscito del tallone da parte della trappola ottica ridurrà fortemente il movimento del tallone. Fai clic e trascina il tallone attraverso il citoplasma e posizionalo a una distanza di ~ 2 μm dall’involucro nucleare (Figura 3A). Assicurarsi che la traiettoria sia impostata in modo che la rientranza del tallone sia perpendicolare alla membrana nucleare. Facoltativamente, se necessario per le misurazioni della posizione del tallone rispetto alla trappola, eseguire la scansione della trappola attraverso il tallone per determinare la rigidità di intrappolamento, k [pN / μm] 54, quindi Δxbead = -F / k (vedere Discussione). Il modulo di micromanipolazione ottica utilizzato in questo protocollo ha una routine integrata per questo scopo. Aprite la finestra di dialogo Scansione particelle nel sottomenu Strumenti . Selezionare la trap che si desidera scansionare e Alta frequenza come metodo di scansione. Selezionate la direzione (x o y) della traiettoria di rientro per la misurazione della scansione del tallone. Apparirà una finestra con la misurazione della rigidità di intrappolamento. Nel grafico, trascinare i due cursori per selezionare l’area di abbondanza lineare corrispondente a F = -kx. L’adattamento lineare alla porzione di dati selezionata verrà aggiornato automaticamente.NOTA: Impostare la posizione iniziale del tallone lontano dalla membrana cellulare (~5 μm), poiché le deflessioni del momento leggero all’interfaccia medio-cella influenzano l’appropriatezza delle misurazioni della forza. Se il nucleo si trova troppo vicino alla membrana cellulare, prova a far rientrare il nucleo dal sito opposto. Scartare la cella se non è possibile. Avviare l’acquisizione delle immagini facendo clic sul pulsante di acquisizione nel software di imaging. Avviare la posizione di trappola e il salvataggio dei dati di misurazione della forza facendo clic su Dati | Salva nella finestra di lettura forzata in tempo reale (aperta come nel passaggio 6.6.1).NOTA: La trap ottica è dotata di un ingresso trigger che può essere collegato all’uscita di temporizzazione della telecamera. Pertanto, i dati di immagine e forza sono sincronizzati hardware e l’elettronica è in grado di mappare i cicli di trappola con il numero di fotogrammi delle immagini durante l’acquisizione. Avviate la traiettoria caricata in precedenza facendo clic con il pulsante destro del mouse sul tallone e selezionando Avvia traiettoria (Start Trajectory). Attendere che la traiettoria sia terminata e che il sistema si stabilizzi. Salvataggio dei dati di misurazione della forza di arresto della trappola. Apparirà una finestra di dialogo di salvataggio dei dati.NOTA: per ottimizzare l’archiviazione dei dati, i dati possono essere decimati selezionando il parametro di decimazione in questa finestra di dialogo (10, 100 o 1000). Interrompere l’acquisizione delle immagini e tracciare i risultati nel software di post-elaborazione di scelta dell’utente. Se la microsfera viene persa durante la routine e il nucleo non può essere rientrato (Figura S2), scartare la misurazione e aumentare la potenza. Si noti che il passaggio 6.5 deve essere ripetuto. Nelle nostre mani, almeno il 95% delle routine viene completato con successo senza perdere il tallone dalla trappola.