Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis
Summary
La cuantificación rápida y eficiente del crecimiento intracelular de M. tuberculosis es crucial para buscar mejores terapias contra la tuberculosis (TB). Este protocolo describe un ensayo de detección colorimétrica basado en caldo utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido para cuantificar el crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con terapias candidatas dirigidas al huésped.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis (TB), fue la enfermedad infecciosa más importante a nivel mundial hasta la llegada de COVID-19. Mtb ha evolucionado para persistir en su entorno intracelular, evadir las defensas del huésped y ha desarrollado resistencia a muchos medicamentos antituberculosos. Un enfoque para resolver la resistencia es identificar los medicamentos aprobados existentes que aumentarán la respuesta inmune del huésped a Mtb. Estos medicamentos podrían reutilizarse como terapias complementarias dirigidas al huésped (HDT) para acortar el tiempo de tratamiento y ayudar a superar la resistencia a los antibióticos.
La cuantificación del crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos es un aspecto crucial de la evaluación del HDT potencial. El estándar de oro para medir el crecimiento de Mtb es contar unidades formadoras de colonias (UFC) en placas de agar. Este es un ensayo lento y laborioso que no se presta a la detección rápida de medicamentos. En este protocolo, se ha adaptado un sistema de cultivo automatizado basado en caldo, que se usa más comúnmente para detectar Mtb en muestras clínicas, para la detección preclínica de terapias dirigidas al huésped. Se evaluó la capacidad del sistema de ensayo de cultivo líquido para investigar el crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos tratados con HDT. Los HDT probados por su capacidad para inhibir el crecimiento de Mtb fueron ácido retinoico todo-trans (AtRA), tanto en solución como encapsulado en micropartículas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y la combinación de interferón-gamma y linezolid. Las ventajas de esta técnica automatizada basada en el cultivo líquido sobre el método CFU incluyen simplicidad de configuración, preparación menos laboriosa y un tiempo de obtención de resultados más rápido (5-12 días en comparación con 21 días o más para las placas de agar).
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis, fue la enfermedad infecciosa más importante a nivel mundial en 20191. Para evadir las defensas del huésped, Mtb subvierte la actividad micobactericida de las células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas (DC), lo que le permite persistir intracelularmente y replicarse2. La falta de una vacuna eficaz para prevenir la tuberculosis pulmonar en adultos y la creciente aparición de cepas resistentes a los medicamentos ponen de relieve la necesidad urgente de nuevas terapias.
Las terapias complementarias dirigidas al huésped (HDT) podrían acortar el tiempo de tratamiento y ayudar a superar la resistencia3. La evaluación preclínica de los candidatos a HDT in vitro para determinar la actividad micobactericida dentro de los macrófagos a menudo se basa en la cuantificación del crecimiento de Mtb por unidades formadoras de colonias (UFC) en placas sólidas de agar. Este es un ensayo lento y laborioso que no se presta a la detección rápida de medicamentos. Los sistemas automatizados de detección microbiana basados en caldos disponibles comercialmente se utilizan más comúnmente en los laboratorios de microbiología clínica para la detección y las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos de Mtb y otras especies micobacterianas en muestras clínicas4. Estos instrumentos miden el crecimiento indirectamente en función de la actividad metabólica bacteriana que conduce a cambios físicos en los medios de cultivo (cambio en los niveles o presión de CO2 uO2) monitoreados a lo largo del tiempo5. La lectura es el tiempo de positividad (TPP), que previamente se ha demostrado que se correlaciona con Mtb CFU en muestras de esputo de pacientes con TB en respuesta al tratamiento 6,7 y en lisados de pulmón y bazo murinos infectados8. Además, se han utilizado sistemas de detección de cultivos líquidos para medir el efecto de las terapias convencionales dirigidas a patógenos sobre el crecimiento de micobacterias en cultivo axénico y macrófagos cultivados 9,10. El instrumento también se ha utilizado para investigar la capacidad innata de las células dendríticas y de los macrófagos alveolares para controlar el crecimiento intracelular de Mtb11,12. Este protocolo experimental demuestra que se puede adaptar un sistema de diagnóstico de cultivo líquido para realizar el cribado preclínico de HDT para TB en macrófagos cultivados. En comparación con la enumeración de UFC, la principal ventaja de esta técnica es que reduce considerablemente el trabajo experimental y el tiempo requerido para cuantificar el crecimiento/supervivencia micobacteriana intracelular. Esta técnica se basa en el acceso a un instrumento de cultivo automatizado que se puede utilizar para evaluar la supervivencia micobacteriana intracelular en células inmunes tratadas con una amplia gama de reactivos farmacológicos dirigidos a las funciones celulares para aumentar la inmunidad del huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los autores han utilizado el método de cultivo líquido descrito en este protocolo para monitorizar el crecimiento de Mtb en macrófagos derivados de monocitos y macrófagos alveolares y células THP-1 diferenciadas con PMA11,16,17. Esta técnica también puede ser modificada para su uso con células no adherentes12. Más recientemente, el instrumento también se utilizó en estudios preclínicos para ev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por Science Foundation Ireland (SFI 08 / RFP / BMT1689), la Junta de Investigación de Salud en Irlanda [HRA-POR / 2012 / 4 y HRA-POR-2015-1145] y Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 – 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
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