Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose
Summary
A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.
Abstract
O Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose (TB), foi o assassino de doenças infecciosas mais significativo globalmente até o advento da COVID-19. O Mtb evoluiu para persistir em seu ambiente intracelular, evadir as defesas do hospedeiro e desenvolveu resistência a muitas drogas antituberculares. Uma abordagem para resolver a resistência é identificar os medicamentos aprovados existentes que aumentarão a resposta imune do hospedeiro ao Mtb. Essas drogas poderiam então ser reaproveitadas como terapias adjuvantes dirigidas ao hospedeiro (HDT) para encurtar o tempo de tratamento e ajudar a superar a resistência aos antibióticos.
A quantificação do crescimento intracelular de Mtb em macrófagos é um aspecto crucial da avaliação do potencial HDT. O padrão-ouro para medir o crescimento de Mtb é a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) em placas de ágar. Este é um ensaio lento, trabalhoso que não se presta a uma triagem rápida de drogas. Neste protocolo, um sistema de cultura automatizado, baseado em caldo, que é mais comumente usado para detectar Mtb em espécimes clínicos, foi adaptado para triagem pré-clínica de terapias direcionadas ao hospedeiro. Avaliou-se a capacidade do sistema de ensaio de cultura líquida para investigar o crescimento intracelular de Mtb em macrófagos tratados com HDT. Os HDTs testados quanto à sua capacidade de inibir o crescimento de Mtb foram ácido retinóico totalmente trans (AtRA), tanto em solução quanto encapsulado em micropartículas poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e a combinação de interferon-gama e linezolida. As vantagens desta técnica automatizada baseada em cultura líquida em relação ao método CFU incluem simplicidade de configuração, preparação menos trabalhosa e tempo mais rápido para os resultados (5-12 dias em comparação com 21 dias ou mais para placas de ágar).
Introduction
O Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da TB, foi o assassino de doenças infecciosas mais significativo globalmente em 20191. Para escapar das defesas do hospedeiro, o Mtb subverte a atividade micobactericida de células imunes inatas, como macrófagos e células dendríticas (DCs), permitindo que ele persista intracelularmente e se replique2. A falta de uma vacina eficaz para prevenir a tuberculose pulmonar adulta e o crescente surgimento de cepas resistentes a medicamentos destacam a necessidade urgente de novas terapias.
As terapias adjuvantes dirigidas ao hospedeiro (HDT) podem encurtar o tempo de tratamento e ajudar a superar a resistência3. A avaliação pré-clínica de candidatos a HDT in vitro para determinar a atividade micobactericida dentro de macrófagos geralmente depende da quantificação do crescimento de Mtb por unidades formadoras de colônias (UFC) em placas de ágar sólido. Este é um ensaio lento, trabalhoso que não se presta a uma triagem rápida de drogas. Sistemas de detecção microbiana automatizados e baseados em caldo comercialmente disponíveis são mais comumente usados em laboratórios de microbiologia clínica para detecção e teste de suscetibilidade a medicamentos de Mtb e outras espécies micobacterianas em espécimes clínicos4. Esses instrumentos medem o crescimento indiretamente com base na atividade metabólica bacteriana que leva a mudanças físicas nos meios de cultura (mudança nos níveis ou pressão de CO2 ou O2) monitoradas ao longo do tempo5. A leitura é do tempo de positividade (TPP), que já demonstrou se correlacionar com a UFC de Mtb em espécimes de escarro de pacientes com TB em resposta ao tratamento 6,7 e em lisados de pulmão e baço murinos infectados8. Além disso, sistemas de detecção de cultura líquida têm sido utilizados para medir o efeito de terapias convencionais dirigidas a patógenos sobre o crescimento de micobactérias em cultura axênica e macrófagos cultivados 9,10. O instrumento também tem sido utilizado para investigar a capacidade inata de células dendríticas e de macrófagos alveolares para controlar o crescimento intracelular de Mtb11,12. Este protocolo experimental demonstra que um sistema de diagnóstico de cultura líquida pode ser adaptado para realizar triagem pré-clínica de HDT para TB em macrófagos cultivados. Em comparação com a enumeração da UFC, a principal vantagem desta técnica é que reduz consideravelmente o trabalho experimental e o tempo necessário para quantificar o crescimento/sobrevivência das micobactérias intracelulares. Esta técnica baseia-se no acesso a um instrumento de cultura automatizado que pode ser usado para avaliar a sobrevivência micobacteriana intracelular em células imunes tratadas com uma ampla gama de reagentes farmacológicos visando as funções celulares para aumentar a imunidade do hospedeiro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os autores utilizaram o método de cultura líquida descrito neste protocolo para monitorar o crescimento de Mtb em macrófagos derivados de monócitos e macrófagos alveolares e células THP-1 diferenciadas com PMA 11,16,17. Essa técnica também pode ser modificada para uso com células não aderentes12. Mais recentemente, o instrumento também foi utilizado em estudos pré-clínicos para avaliar o áci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), pelo Health Research Board in Ireland [HRA-POR/2012/4 e HRA-POR-2015-1145] e pelo Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 – 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
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