Gebruiksvriendelijke, high-throughput en volledig geautomatiseerde data-acquisitie software voor cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje

Cryo-EM met één deeltje is een mainstream structurele biologietechniek geworden voor structuurbepaling met hoge resolutie van biologische ^{macromoleculen1}. Reconstructie van één deeltje is afhankelijk van het verkrijgen van een groot aantal microfoto’s van verglaasde monsters om tweedimensionale (2D) deeltjesbeelden te extraheren, die vervolgens worden gebruikt om een driedimensionale (3D) structuur van een biologisch macromolecuul te ^{reconstrueren2,3}. Vóór de ontwikkeling van DED’s varieerde de resolutie die werd bereikt met een reconstructie van één deeltje tussen 4 en 30 ^Å4,5. Onlangs is de haalbare resolutie van cryo-EM met één deeltje verder gegaan dan 1,8 ^Å6. DED en geautomatiseerde software voor gegevensverzameling hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan deze ^{resolutierevolutie7}, waarbij menselijke tussenkomst voor gegevensverzameling minimaal is. Over het algemeen wordt cryo-EM-beeldvorming uitgevoerd met lage elektronendosissnelheden (20-100 e / ^Å2) om door elektronenbundels geïnduceerde stralingsschade van biologische monsters te minimaliseren, wat bijdraagt aan de lage signaal-ruisverhouding (SNR) in het beeld. Deze lage SNR belemmert de karakterisering van de hoge resolutie structuren van biologische macromoleculen met behulp van single-particle analyse.

De nieuwe generatie elektronendetectoren zijn CMOS-gebaseerde detectoren (complementary metal-oxide-semiconductor), die deze lage SNR-gerelateerde obstakels kunnen overwinnen. Deze CMOS-camera’s met directe detectie maken een snelle uitlezing van het signaal mogelijk, waardoor de camera bijdraagt aan een betere puntspreidingsfunctie, geschikte SNR en uitstekende detective quantum efficiency (DQE) voor biologische macromoleculen. Directe detectiecamera’s bieden een hoge ^SNR8 en weinig ruis in de opgenomen beelden, wat resulteert in een kwantitatieve toename van de detective quantum efficiency (DQE) – een maat voor hoeveel ruis een detector aan een afbeelding toevoegt. Deze camera’s nemen ook films op met een snelheid van honderden frames per seconde, wat snelle gegevensverzameling mogelijk ^maakt9,10. Al deze eigenschappen maken snelle directe detectiecamera’s geschikt voor toepassingen met een lage dosis.

Bewegingsgecorrigeerde stapelafbeeldingen worden gebruikt voor gegevensverwerking om 2D-classificatie te berekenen en een 3D-dichtheidskaart van macromoleculen te reconstrueren met behulp van verschillende softwarepakketten zoals ^RELION11, ^FREALIGN12, ^cryoSPARC13, ^cisTEM14 en ^EMAN215. Voor analyse van één deeltje is echter een enorme dataset nodig om een structuur met hoge resolutie te bereiken. Daarom zijn automatische tolheffingen voor gegevensverzameling zeer essentieel voor het verzamelen van gegevens. Om grote cryo-EM datasets vast te leggen, zijn de afgelopen tien jaar verschillende softwarepakketten gebruikt. Speciale softwarepakketten, zoals ^AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, ^SerialEM19, UCSF-Image420, _TOM221, ^SAM22, ^JAMES23, ^JADAS24, EM-TOOLS en EPU, zijn ontwikkeld voor geautomatiseerde gegevensverzameling.

Deze softwarepakketten gebruiken routinetaken om automatisch gatposities te vinden door de afbeeldingen met lage vergroting te correleren met afbeeldingen met een hoge vergroting, wat helpt bij het identificeren van gaten met glasachtig ijs van geschikte ijsdikte voor beeldacquisitie onder omstandigheden met een lage dosis. Deze softwarepakketten hebben het aantal repetitieve taken verminderd en de doorvoer van de cryo-EM-gegevensverzameling verhoogd door gedurende meerdere dagen continu een enorme hoeveelheid gegevens van goede kwaliteit te verzamelen, zonder enige onderbreking en de fysieke aanwezigheid van de operator. Latitude-S is een vergelijkbaar softwarepakket, dat wordt gebruikt voor automatische gegevensverzameling voor analyse van één deeltje. Dit softwarepakket is echter alleen geschikt voor K2/K3 DED’s en wordt bij deze detectoren geleverd.

Dit protocol demonstreert het potentieel van Latitude-S in de geautomatiseerde beeldacquisitie van SARS-CoV-2 spike-eiwit met een directe elektronendetector uitgerust met een 200 keV cryo-EM (zie de tabel met materialen). Met behulp van deze tool voor gegevensverzameling worden automatisch 3.000 filmbestanden van SARS-CoV-2 spike-eiwit verkregen en wordt verdere gegevensverwerking uitgevoerd om een spike-eiwitstructuur met een resolutie van 3,9-4,4 Å te verkrijgen.