يصف هذا البروتوكول إجراء لبناء صفائف ألياف الكربون microelectrode للتسجيلات المزمنة والحادة في الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي في الماوس(Mus musculus)والنمس(موستيلا putorius furo) من مناطق الدماغ متعددة. كل خطوة، بعد شراء ألياف الكربون الخام لزرع صفيف microelectrode، ويرد وصف بالتفصيل، مع التركيز على بناء صفيف microelectrode.
توفر صفائف الأقطاب الكهربائية متعددة القنوات نظرة ثاقبة على الدماغ العامل وتعمل على توضيح العمليات العصبية على مستوى الخلية الواحدة والدائرة. تطوير هذه الأدوات أمر بالغ الأهمية لفهم السلوكيات المعقدة والإدراك وللنهوض بالتطبيقات السريرية. ومع ذلك، فإنه لا يزال يشكل تحديا لتسجيل بكثافة من مجموعات الخلايا بشكل ثابت ومستمر على مدى فترات زمنية طويلة. تتميز العديد من الأقطاب الكهربائية الشائعة ، مثل tetrodes صفائف السيليكون ، بأقطار متقاطعة كبيرة تنتج تلفا عند الإدراج وتثير استجابات الأنسجة التفاعلية المزمنة المرتبطة بموت الخلايا العصبية ، مما يعوق تسجيل نشاط عصبي مستقر ومستمر. بالإضافة إلى ذلك، تظهر معظم حزم الأسلاك تباعد واسع بين القنوات، مما يمنع التسجيل المتزامن من عدد كبير من الخلايا المتجمعة في منطقة صغيرة. توفر صفائف الألياف الكربونية microelectrode الموصوفة في هذا البروتوكول حلا يمكن الوصول إليه لهذه المخاوف. توفر الدراسة طريقة مفصلة لتصنيع صفائف ألياف الكربون microelectrode التي يمكن استخدامها لكل من التسجيلات الحادة والمزمنة في الجسم الحي. الخصائص الفيزيائية لهذه الأقطاب الكهربائية جعلها مثالية للتسجيلات المستقرة والمستمرة على المدى الطويل في كثافات الخلايا العالية، مما يمكن الباحث من إجراء تسجيلات قوية لا لبس فيها من وحدات واحدة عبر أشهر.
الأقطاب الكهربائية صفائف القطب هي أدوات قيمة لفهم كيفية معالجة الدماغ للمعلومات على مستوى الخلايا العصبية. في حين أن التسجيلات الكهربية كانت قابلة للتحقيق لأكثر من قرنينمن الزمان 1، فإنه لا يزال من غير الممكن قياس نشاط الدوائر العصبية بأكملها في القرار المكاني والزمني المطلوب لالتقاط ارتفاع الخلايا العصبية الفردية. على الرغم من أن الأساليب غير الغازية، مثل تخطيط الدماغ الكهربائي2،تضاريس الانبعاثات البوزيترونية3،والتصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي4 تسمح لقياسات الدماغ كله، فإنها لا يمكن تحقيق الدقة المكانية والزمنية اللازمة لحل نشاط الدوائر العصبية2،5. في المقابل، يمكن أن تحقق طرق التصوير مثل التصوير البصري باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا دقة مكانية أحادية الوحدة، ولكنها تطرح قضايا مثل الدقة الزمنية المنخفضة وضعف الانتقائية3و4و5و6. التسجيلات الكهربائية هي بديل قوي لهذه الأساليب. تسجيل الأقطاب الكهربائية توفير دقة زمنية لا مثيل لها والسماح للمستخدم لإجراء القياسات بدقة ارتفاع الوقت في أي منطقة من الدماغ7. بالإضافة إلى ذلك، صفائف متعددة الأقطاب المزروعة بشكل مزمن (MEAs) تمكن على نطاق واسع (عشرات إلى مئات الخلايا)، تسجيلات وحيدة الخلية في الحيوانات تتصرف على مدى فترة من الأيام إلى الأشهر8،9. ومع ذلك، المسابير السيليكون التي تسجل في كثافات أعلى لها بصمة كبيرة وهي الغازية للغاية، وصفائف مزروعة بشكل مزمن غالبا ما تولد استجابة التهاب، تغليف الأنسجة، والموت العصبي10،11،12،13.
وقد أدت القيود المفروضة على الأقطاب الكهربائية الموجودة في الابتكارات الأخيرة التي تسمح لتسجيلات مستقرة وعالية الدقة وطويلة الأجل. تتكون الأقطاب الكهربائية النموذجية من موصل معدني ، مثل التنغستن أو البلاتين إيريديوم ، أو تعتمد على السيليكون أو البوليمر. في حين أن صفائف الأسلاك الدقيقة القائمة على المعدن يمكنها الحفاظ على تسجيلات مستقرة طويلة الأجل ، إلا أن لها بصمة أكبر بكثير ، مع قطر سلك واحد يتراوح بين 10-200 ميكرومتر14. في المقابل، صفائف القطب القائم على السيليكون تسفر عن تسجيلات مع دقة المكانية عالية، ولكن نظرا لتصميمها جامدة نسبيا، فإنها عادة ما تكون غير قادرة على الحفاظ على إشارة وتسجيل من نفس الخلايا العصبية على مدى أشهر عديدة15. وقد أسفرت التطورات الأخيرة في صفائف السيليكون القائمة في الأقطاب الكهربائية التي يمكن أن تؤدي بشكل موثوق التسجيلات المزمنة، ولكن لا يمكن استخدام هذه الصفائف لتسجيل من مناطق الدماغ العميق في الحيوانات الكبيرة وتهدف للتسجيلات الخطية9. وقد أدى التقدم في صفائف البوليمر في زيادة المرونة وتسجيل الاستقرار من وحدات واحدة وتوفر إمكانية لتسجيلات عالية الكثافة في المستقبل القريب ولكن مع توافر محدود في الوقت الحاضر8،16،17. تسمح ألياف الكربون بالتسجيلات عالية الكثافة مع المواد الجاهزة الموضحة هنا.
وقد استخدمت ألياف الكربون تسجيل microelectrodes لعقود، مع أول أقطاب ألياف الكربون تتكون من ألياف الكربون واحد إدراجها في micropipette الزجاج. واستخدمت هذه microelectrodes لتسجيلات خارج الخلية وحدة واحدة، وعلى الرغم من أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء كانت مماثلة لأفضل التنغستن في الزجاج microelectrodes، كانت مفيدة نظرا لمرونتها، وانخفاض قيم المعاوقة، والبساطة لتصنيع18،19. تسارعت الجهود الرامية إلى تطوير صفائف أقطاب ألياف الكربون مؤخرا بسبب قدرات الاستشعار البيولوجي لألياف الكربون. بالإضافة إلى زيادة التوافق البيولوجي والتوصيلية الكهربائية الاستثنائية ، فإنها تتميز بمجموعة فريدة من الخصائص ، بما في ذلك مقاومة درجات الحرارة العالية ، والكثافة النسبية المنخفضة ، وقوة الشد العالية ، وتصلب الانحناء المنخفض ، وحساسية الكشف العالية ، ومنطقة صغيرة مقطعية10،12. كل هذه الخصائص قد حفزت على تطوير صفائف ألياف الكربون microelectrode (CFEAs) التي تسهل المزمنة, مستقرة, تسجيلات عالية الغلة من الخلايا العصبية واحدة. ويمكن الآن أن تكون وضعت هذه CFEAs باليد20،21 ( الشكل1) ، مما أسفر عن صفائف microelectrode التي يمكن أن تعقد الخلايا العصبية واحدة على مدى أشهر. وصف هنا هو عملية البناء للوصول لCFEAs التي تم تكييفها بطريقتين للتسجيلات الحادة والمزمنة من الخلايا العصبية الفردية في نوعين.
يصف هذا البروتوكول كل خطوة ضرورية لبناء CFEA وظيفية للاستخدام الحاد والمزمن على حد سواء. العملية الموصوفة قابلة للتخصيص لاحتياجات الباحث ، مما يجعلها خيارا متاحا وغير مكلف لمراقبة الخلايا العصبية الفردية على مدار أشهر. يوضح البروتوكول جدوى تسجيل كل من النشاط القوي لوحدة واحدة في غضون دقائق من الزرع في مخدر ، وعلى مدى أربعة أشهر في مستيقظ يتصرف ، مما يوضح إمكانات هذه CFEAs لدراسة التغيرات قصيرة الأجل وطويلة الأجل في الاستجابات العصبية.
وقد تم اختبار خطوات البروتوكول الموصوفة بدقة وتحسينها بمرور الوقت للتوصل إلى إجراء فعال يمكن إكماله بسرعة، بتكلفة هامشية منخفضة (< 100.00 دولار)، مع القدرة على تسجيل وحدات فردية لا لبس فيها، بكثافة وثبات على مدى أشهر. يمكن الانتهاء من خطوات البناء في أقل من يوم واحد، وسوف تنتج إشارات كهربية التي هي مماثلة لأي مجموعة تجارية رائدة. وCFEAs أيضا بصمة أصغر بكثير (حزمة من 16 قناة من الألياف وقطرها ~ 26 ميكرومتر) من صفائف تجارية مماثلة، وعدم توافقها البيولوجي يجعلها مناسبة للاستخدام على المدى الطويل13. الأهم من ذلك، هناك العديد من الخطوات الحاسمة والتعليمات التي يجب اتباعها من أجل إنتاج CFEA يعمل مع أداء مماثل.
نظرا لهشاشة ألياف الكربون ، يجب التعامل معها بأقصى قدر من العناية. التعامل معها مع ملقط حاد أو غيرها من الأدوات قد يؤدي إلى كسر الألياف. بالإضافة إلى ذلك، من المهم بناء CFEAs في الفضاء مع حركة الهواء محدودة بحيث الألياف لا تهب بعيدا. عندما المشتعلة الجزء الخلفي من الألياف، وأخف وزنا يحتاج فقط إلى أن تتحرك في حركة ذهابا وإيابا لفترة وجيزة جدا، لحوالي 1 ق. الخطوات التالية لإزالة العزل هذه حاسمة لبناء قطب كهربائي مع قنوات العمل. وينبغي تغذية نصائح ملتهبة في الرقصة دون أي اتصال إضافي. ثم، عند ملء الحوض مع أسمنت الأسنان، من المهم أن يتم تطبيق الاسمنت بعناية ويملأ تماما القنوات وحوض القمع، وإغلاق الفتحات دون ملء لهم. ثم ينبغي الشفاء تماما من الاسمنت الأسنان مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل المتابعة. وبمجرد الانتهاء من ذلك، ينبغي حقن الطلاء الفضي في كل قناة حتى تملأ تماما ولكن لا تتسرب. هذه هي الخطوة الأكثر متغير في العملية. يمكن لأي تعبئة زائدة أن تنتج التحدث المتبادل بين القنوات، ويمكن أن يؤدي عدم كفاية التعبئة إلى فشل الاتصال. إذا لم تتمكن من حقن الطلاء الفضي باستخدام إبرة 25 G ، فمن المرجح أن الحل لزج للغاية ، وفي هذه الحالة ، يمكن إضافة كمية صغيرة من أرق الطلاء لإنشاء محلول أكثر مرونة. بمجرد تعبئة جميع القنوات ، وإدخال موصل headstage ، من المهم السماح للصفيف بالعلاج لمدة 24 ساعة قبل تأمين الموصل باستخدام أسمنت الأسنان. وجدنا أن الفشل في القيام بذلك خفض عدد القنوات المتصلة. تطبيق كمية سخية من الاسمنت الأسنان مهم أيضا بحيث موصل لا قطع عند التواصل مع نظام الحصول على إشارة. إذا أصبحت منفصلة، فمن الممكن محاولة إعادة الاتصال مع ملء المتكررة من القنوات مع الطلاء الفضي، ولكن يجب على المستخدم اختبار قيم المعاوقة من CFEA لتقييم عدد من القنوات المتصلة. السماح للأسمنت الأسنان لعلاج بين عشية وضحاها كما يعمل على منع مفرزة المحتملة.
إن قياس مقاومة القطب الكهربائي سيوفر تقديرا دقيقا للقنوات المتصلة. ويمكن القيام بذلك بعد غمر الأرض والأسلاك المرجعية ونصائح ألياف الكربون في برنامج تلفزيوني. لقد لاحظنا أن المعاوقة العالية (>15 MΩ) تدل على قناة مفتوحة وغير متصلة. قبل حقن التيار والكهرباء، يمكن أن يكون للقناة المتصلة مجموعة من قيم المعاوقة التي يجب أن تنخفض بشكل كبير مع هذه العملية. وبلغ متوسط عدد القنوات المتصلة (المعاوقة < 4 MΩ بعد الحقن الحالي) لكل قطب كهربائي من 16 قناة 12.96 ± 2.74 (متوسط ± SD؛ N = 48 أقطاب كهربائية). تم اختبار عدد من مرات الطلاء الكهربائي، وأنتجت 30 ق عزل إشارة متفوقة بين مواقع التسجيل (الشكل 5). في حين أنه ثبت جيدا أن PEDOT-pTS12و24و25و PEDOT-TFB21 توفر خيارات موثوقة لإعداد مواقع تسجيل ألياف الكربون ، وجدنا أن الطلاء بالذهب ، وهو طريقة مثبتة ويمكن الاعتماد عليها لأقطاب الطلاء الكهربائي للزرع المزمن27،28 ، وزيادة سهولة زرع ومنع نصائح القطب من تتجمع معا. في إنتاج قيم المعاوقة النهائية أقل من 0.2 MΩ في المتوسط ، تثبت هذه الطريقة أنها مماثلة للقيم التي تحققت باستخدام PEDOT-TFB21 و PEDOT-pTS26.
عند زرع صفيف microelectrode ، من المهم متابعة إدراج نصائح ألياف الكربون تحت المجهر بصريا. يجب أن يكون الإدراج الناجح واضحا ، مع عدم وجود ثني للألياف. إذا كانت الألياف ويبدو أن التواء، فمن غير المرجح أنها سوف تدخل بنجاح في الدماغ. في هذه الحالة، يجب تعديل زاوية المسبار لمحاولة ثانية. يمكن أن تستمر هذه العملية حتى يتم إدراج المسبار بنجاح. بمجرد أن يكون القطب في العمق المطلوب ، وجدنا أن الانتظار لمدة 30 دقيقة على الأقل سيسمح للمسبار بالاستقرار بالحصول على الإشارة المثلى (التسجيلات الحادة).
وتوفر العقود مقابل الفروقات الموصوفة، بالإضافة إلى صغر حجمها وتناواها البيولوجي، بديلا قويا وقابلا للتخصيص للصفائف التجارية نظرا لسهولة بنائها وانخفاض تكلفتها. أكبر تقييد ل CFEAs مفصلة في هذا البروتوكول هو قابليتها للتحجيم. نظرا للطبيعة اليدوية لبنائها ، قد لا يكون التوسع في التصاميم مع مئات مواقع التسجيل عملية. بالإضافة إلى ذلك، فإن التقدم في تصنيع صفيف microelectrode باستخدام تكنولوجيا النانو سيمكن التسجيلات السكانية على نطاق أوسع من الأساليب الموصوفة هنا. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول يوفر إمكانية الوصول إلى CFEA للمختبرات المهتمة بالتصنيع على مقاعد البدلاء لأقطاب ألياف الكربون. لم نلاحظ أي فقدان للاستقرار أو انخفاض في قوة السعة الارتفاع على مدى فترة التجارب المزمنة لمدة 120 يوما، كما هو مبين من قبل قناة واحدة ممثل نموذجية من ملاحظاتنا على ذلك النطاق الزمني(الشكل 6A–ه). بالإضافة إلى ذلك، تظهر CFEAs القدرة على نشاط وحدة واحدة مستمرة، كما ظلت أربع وحدات واحدة ملحوظة بعد 11 شهرا من زرع في الماوس (الشكل 6G،H). ومن الممكن أيضا الحصول على مستقرة، تسجيلات وحدة واحدة بشكل حاد(الشكل 7)،والذي يقدم ميزة على العديد من الأقطاب التجارية الأخرى لدراسة الخلايا العصبية واحدة على مدى فترات زمنية قصيرة. وفي المستقبل، سيمكن تطوير هذه المسابير المرنة والمتوافقة بيولوجيا ذات الأقطار الدنيا من دراسة العمليات المعقدة. ستوفر هذه الأدوات فائدة كبيرة في تقدم التكنولوجيا العصبية ، بما في ذلك التطبيقات في واجهات الدماغ والآلة (BMIs) ، والتي تتطلب استقرار مستمر وطويل الأجل29.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر غريغ Guitchounts للتوجيه مع تصميم القطب والبناء وتيم غاردنر لفتح مختبره والمرافق لنا. نود أن نشكر كريستوس ميشاس على مساعدته في استخدام PDS في منشأة Bio-Interface و Technology الأساسية ونيل ريتر وجون سبيرياس وديفيد لاندسمان لمساعدتهم في تصميم الإصدارات المبكرة من الرقصة ذات ال 16 قناة. نود أن نشكر تيم كافانو على مساعدته في تصوير SEM في مركز أنظمة النانو في جامعة هارفارد في جامعة هارفارد.
#10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool – sharp-tipped |
30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Deionized water | Electroplating component | ||
Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
JRClust | Ferret spike sorting software | ||
Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
Sticky notes | Post-it | Building tool | |
Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |