ヒト末梢血リンパ球におけるγ-H2AX Fociアッセイの自動微視的スコアリング法

この研究は、西ケープ大学倫理委員会の生物医学研究倫理委員会によって承認されました – コードBM18/6/12。 1. ソリューションの準備48 細胞固定液(PBS中3%PFA) 適切な個人用保護具(PPE)を着用し、ヒュームフードで作業し、200 mLの蒸留H2Oに20gのパラホルムアルデヒドを加え、混合物を60°Cに加熱して溶解を助けます。 PFAが溶解したら、30分間にわたって慎重に5 N NaOHの40滴を加え、室温まで冷却します。1 M HClを使用してpH 7に調整し、蒸留H2Oで250 mLの最終容積までを作ります(アリコートは-20°Cで1年間保存することができます)。この溶液から25 mLを41.7 mL PBSに加えると、3%のPFA溶液が得られます。 1%牛血清アルブミン(BSA)溶液:1000 mLのPBSにBSAの10gを加え、溶解するまで混ぜます。使用するまで4°C(最大72時間)で保管してください。 1:500の濃度でTriton-X溶液:1μLのTriton-XをPBSの500 μLに加え、使用するまで4°Cで保存します(最大24時間)。 抗体ソリューション 一次抗体 – 抗γ-H2AX濃度1:500:1%BSA溶液の500 μLに抗γ-H2AXを1μL加え、使用するまで4°Cで保存します(最大24時間)。 二次抗体 – 1:1000の濃度でDAM-TRITC:1%BSA溶液の1000 μLに1μLのダム-TRITCを加え、使用するまで4°Cで保存します(最大24時間)。 コンプリート・ロズウェル・パーク記念研究所(cRPMI)メディア 濾過した牛胎児血清(FBS)とペニシリンストレプトマイシンを無菌ボトルのRPMI 1640培地に加え、10Sおよび1%ペニシリンストレプトマイシンの最終濃度を与える。 2. サンプルの作成 注:このプロトコルでは、末梢全血サンプルは、健康な成人ボランティアからリチウムヘパリンコレクションチューブの静脈穿刺によって収集されます(インフォームド・コンセント付き – BM18/6/12西ケープ大学倫理委員会生物医学研究倫理委員会)。始める前に、血液および1.077 g/mLの密度媒体が室温に順応していることを確認してください。 準備されたバイオセーフティキャビネットで、PBSで末梢全血を1:1体積で希釈し、希釈した血液を1.077g/mLの密度で2体積の培地に穏やかに重ねます。45°で傾斜したチューブを保持することで、密度媒体上に血液を徐々に重ね、血液と密度媒体が混ざらないようにすることが重要です。 慎重に遠心分離機にサスペンションを転送し、20分間900 x gで回転します。その後、新しい滅菌の円錐管にのみ「曇り」層をピペットし、1000 x gで10分間PBSと遠心分離機でチューブを充填する。その後、ピペットで上清を吸引し、ペレットを乱さないよう慎重に、PBMCペレットを1mLPBSで慎重に再懸濁し、PBSでチューブを充填する。 上記の洗浄工程をさらに2回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。 血球計を使用してPBMCの数を数え、成人ドナーからの末梢血の各mLは1 – 1.5 x 106 PBMCs49の大まかな平均をもたらすことを認識する。カウント後、PBMCペレットを1mLのcRPMI中の8 x 105 リンパ球の濃度に希釈します。次に、分離されたPBMC溶液から約2 x 106 PBMCまたは2.5mLを、照射用の無菌で円錐形のチューブに加えます。 3. サンプル照射 注意:放射線防護ガイドラインに従って放射線単位を取り扱い、常に物理的な線量計を着用してください。使用する照射システムが校正され、正しい期待される線量が達成されるように設定されていることを確認します。 60Coソースを使用して、室温でPBMCsを照射します。南アフリカ国立計量研究所(NMISA)50から得られたチャンバーキャリブレーション因子を持つファーマー117チャンバーでキャリブレーション(TRS-398プロトコル) このアッセイでは、5 mm アクリル シート(ビーム入力ビルドに使用)と、現在の 60Co ソース線量率 0.57 Gy/min の 50 mm 背面散乱材料の間に円錐チューブを配置 ×し、300 mm の 300 mm の均質フィールド サイズを 300 mm で 300 mm の距離から表面距離まで置きます。 0.125、0.500、1.000、1.500および2.000 Gyの等級線でPBMCsを照射し、シャム照射された対照サンプルを維持し、コントロールルームで周囲の放射線被ばくを受け取る。 γ-H2AX病巣の最大数に達するために、加湿した5%CO2 インキュベーターで37°Cで1時間照射したサンプルをインキュベートします。メモ:インキュベーション時間は、実験設計に従って変更することができます。 4. スライド準備 注: スライドの設定については 、図 1 を参照してください。 正に帯電した表面でコーティングされたスライドを使用して3枚のスライド(技術的な繰り返し)を準備し、照射状態(または円錐管あたり)の接着性を向上させます。スライドをクリップホルダに入れ、フィルターカードを上に追加し、最後に漏斗を追加します。スライドクリップを固定し、サイト遠心分離機に配置します。 細胞懸濁液の250 μLを漏斗(200,000細胞/スライド)に加え、細胞遠心分離機を使用して30 x gで5分間回転します。 細胞内心分離後、クリップホルダからスライドを取り出し、疎水性ペンを使用して、染色プロセス中に結合細胞上の免疫蛍光染色を保持するために、細胞と一緒にスポットの周りに円を描く。 5. 固定および免疫蛍光γ-H2AX染色 注:すべてのソリューションは、疎水性円によってマークされている細胞領域に慎重に直接追加されます。染色液は、ピペットチップが細胞を破壊することなく、スライドの上にわずかに分配されます。ソリューションはスライド全体に追加されません。 20分間、準備したばかりの3%PFAでスライドを固定します。注:スライドは、免疫染色が行われる前に最大2日間、4°Cで0.5%PFAを含むPBSに保存することができます。その後、PBSでコプリン瓶のスライドを5分間洗浄し、10分間冷たいTriton-X溶液の100 μLで細胞を覆い、透過を可能にします。 トリトン-X溶液をティッシュペーパーで外し、スライドを1%BSA溶液で10分間3回洗います。これは、非特異的抗体結合を遮断することによって不要な背景を防止するために行われる。 1:500希釈された一次抗γ H2AX抗体の100 μLを加えて室温で、加湿室で1時間、長方形スライド保存ボックスの基部に湿ったティッシュペーパーを加えることで容易に実現します。 抗体溶液をティッシュペーパーにチップオフし、1%BSA溶液を用いて10分間コプリンジャーで3回のスッシュを行い、非結合一次抗体を除去し、二次抗体の非特異的結合を防止します。 1:1000希釈二次二次DAM-TRITC抗体溶液の100 μLを加湿室で1時間インキュベートします。組織紙に抗体溶液を傾け、PBSでスライドを3回10分間洗浄します。 最後に、疎水性円の外に柔らかく、ほこりのないティッシュペーパーでスライドを乾燥させ、水性取り付け媒体で分解されたDAPIの1〜2滴を加え、24 x 50 mmのカバースリップでスライドを静かに覆い、閉じ込められた気泡がなく、一晩で冷蔵庫に置かないようにします。スライドは、スキャン前に最大2週間、4°Cで保存することができます。 6. スライドの自動スキャンとスコアリング 注:スキャンシステムには、蛍光顕微鏡、ビデオ画像のリアルタイムデジタル化のためのフレームグラバに接続された高解像度CCD(荷電結合デバイス)カメラ、スキャンステージ、手動移動用トラックボール、3Dマウス、高速PCとモニタ、アーカイブ用ハードドライブが必要です(図2)。 分類子の設定注: 分類子は、システムがセルを検出する方法を定義するパラメーターのセットです。事前に分類された画像フィールドに基づくトレーニングから得られます。分類器は顕微鏡の拡大、細胞のタイプおよび実験室のために特定である。したがって、分類子は、現在の条件に適合させるために、次のパラメータの変更を必要とします。評価前に、参照スライドで設定をテストすることをお勧めします。 画像取得: 40倍のドライ目的を使用してイメージングします。すべてのセルで同等の画質を実現するには、カメラ統合時間を自動モードに設定します。両方のカラーチャンネル(カメラゲイン4.0)の最大統合時間を少なくとも1秒に設定します。信号チャネルは、10のフォーカスプレーンと平面間の14/40 μmで獲得されます。 セル選択:20.00 μm2 および76.00 μm2 の範囲内のPBMCが検出されます。最大凹度深度を 0.05 に、最大アスペクト比を 1.4 に設定します。相対グレーレベルのしきい値を 20% に設定します。 セル処理: DAPI カウンターステイン チャネルをヒストグラム最大アルゴリズムで処理し、バックグラウンドを減らします。信号チャネルは、バックグラウンドを低減し、信号を強化するために、TopHatフィルタ(強度7、平滑係数0)で処理されます。 信号カウント: デバイスのオブジェクトカウント機能を使用して、フォシをカウントします。残りのバックグラウンド信号の誤検出評価を避けるために、セル内で最も明るい物体と比較した場合に、強度の少なくとも30%を示す信号のみがカウントされます。 70%エタノールで静かに洗浄した後、自動スキャンプラットフォームまたはスライドステージにスライドを挿入/配置して、ほこりを取り除きます。 スライド設定 – スライド設定ダイアログメニューを開く (図 3) [正しい データ パス] を選択すると、検索結果のスライド ファイルの保存場所を指定します。 スライドに名前を付け、各スライドには一意の名前を付ける必要があります。一連のスライドを列挙リストの形式で入力する場合は、スライド番号のワイルドカードとして ‘?’ を使用できます。 セクション 1.1 – 1.4 (図 4)で説明されているように、適切な分類子を選択します。 [検索ウィンドウ] を選択し、サイト遠心分離セルの円に一致する検索ウィンドウ定義が存在する場合は [事前定義] を選択し、[サイズ] 列で該当する定義を選択するか、定義済みの検索ウィンドウ定義がない場合は [手動] を選択します。この場合、[サイズ] 列を設定する必要はありません。 [ 最大セル数] を 選択し、スキャンに必要なセルの最大数を追加します。選択した検索ウィンドウが最大セル数に達した直後に完全にスキャンされていない場合でも、検索は終了します。バイオドシメトリー用途では、1スライド当たり1000個の細胞の自動採点で十分であり、血液試料当たり3枚のスライドが調製されることを考慮する。 [OK] を クリックして設定を確定します。 スライド スキャンのセットアップ サイドバーの 検索 ボタンをクリックします。スライド設定で[手動検索ウィンドウ]を選択した場合、スキャン領域を決定するためのダイアログが開きます(図5)。10xの目的を使用して、マウスの左クリックで検索フィールドの2つのコーナーを固定することにより、インタラクティブにスライド上の長方形の検索領域を選択します。 これはOK ボタンで確認できます。検索ウィンドウが定義済みの検索ウィンドウを参照している場合、この手順は省略されます。 フォーカス開始位置を調整するよう求められます。参照オブジェクトが自動的に選択され、ソフトウェアは、各スライドの(40x目標を使用して)参照核をフォーカスし、中央に配置し、OKで設定を確認するようにユーザーに求めます。システムは自動的にすべてのスライドに連続して移動します。必要に応じて、このステップのライブイメージ設定 – 統合時間を調整します(図5)。 すべての顕微鏡の設定を確認し、システムプロンプトを 確認します。自動焦点とスキャン手順が開始されます。スキャンが完了すると、データは分析のためにコンピュータに保存されます。スキャンシステムは、スキャンが完了すると自動的にオフになります。メモ:顕微鏡チューブのレバーが、すべての光をカメラに流す位置に置かないようにしてください。 検索終了は、検索全体がスキャンされた場合、最大セル数に達した場合、または検索がキャンセルされた場合に、検索が終了します。 スライド分析注 : 完了したスキャンは 図 6に示されています。 スキャンが完了したら、サイドバーの ギャラリー ボタンをクリックします。検出されたセルの小さな画像で構成されるギャラリーを確認します。このウィンドウ (図 7)では、ドロップダウン メニューから選択する条件によってギャラリーに保存されているセルを指定します。セルは通常、検出された順に表示されます。 検出されたセルの品質測定の分布と平均値、およびスコア付けされた病巣の標準偏差を指定するには、[ ヒストグラム/特徴値図 ](図8)をクリックします。