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Cancer Research

Eine automatisierte mikroskopische Scoring-Methode für den γ-H2AX-Foci-Assay in humanen peripheren Blutlymphozyten

Published: December 25, 2021
doi:
10.3791/62623
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1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department,iThemba LABS, 2Department of Biotechnology,University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences,University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences,Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine,University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

Summary

Dieses Protokoll präsentiert die Objektträgervorbereitung und das automatisierte Scoring des γ-H2AX-Foci-Assays an peripheren Blutlymphozyten. Um die Methode und Sensitivität des Assays zu veranschaulichen, wurden isolierte Lymphozyten in vitrobestrahlt. Diese automatisierte Methode des DNA-DSB-Nachweises ist nützlich für schnelle und biologische Dosimetrieanwendungen mit hohem Durchsatz.

Abstract

Ionisierende Strahlung ist ein starker Induktor für DNA-Schäden und ein gut dokumentiertes Karzinogen. Die biologische Dosimetrie umfasst den Nachweis biologischer Wirkungen, die durch die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung induziert werden, um eine individuelle Dosisabschätzung vorzunehmen. Dies ist im Rahmen von Strahlennotfällen relevant, bei denen Gesundheitsbewertungen und die Planung der klinischen Behandlung exponierter Opfer von entscheidender Bedeutung sind. Da DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) als die tödlichste Form von strahleninduzierten DNA-Schäden gelten, stellt dieses Protokoll eine Methode zum Nachweis von DNA-DSB in Blutproben dar. Die Methodik basiert auf dem Nachweis eines fluoreszenzmarkierten phosphorylierten DNA-Reparaturproteins, nämlich γ-H2AX. Die Verwendung einer automatisierten Mikroskopieplattform zur Bewertung der Anzahl der γ-H2AX-Brennpunkte pro Zelle ermöglicht eine standardisierte Analyse mit einer signifikanten Verringerung der Durchlaufzeit. Daher hat der γ-H2AX-Assay das Potenzial, einer der schnellsten und empfindlichsten Assays für die biologische Dosimetrie zu sein. In diesem Protokoll werden Vollblutproben von gesunden erwachsenen Freiwilligen in vitro verarbeitet und bestrahlt, um die Verwendung des automatisierten und sensitiven γ-H2AX-Foci-Assays für Biodosimetrieanwendungen zu veranschaulichen. Zum Einsatz kommt ein automatisiertes Objektträger-Scanning-System und eine Analyseplattform mit integriertem Fluoreszenzmikroskop, die eine schnelle, automatische Bewertung von DNA-DSB mit reduziertem Bias-Grad ermöglicht.

Introduction

Seit ihrer Entdeckung ist ionisierende Strahlung (IR) zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der heutigen medizinischen und industriellen Praxis sowie in landwirtschaftlichen und militärischen Anwendungen geworden. Der breite Einsatz von IR erhöht jedoch auch das Risiko einer Überbelichtung von Strahlung sowohl für professionelle Strahlenarbeiter als auch für die Öffentlichkeit. IR ist ein bekanntes physikalisches Karzinogen, das DNA-Schäden direkt oder indirekt induzieren kann, was zu erheblichen Gesundheitsrisiken führt 1,2. Daher ist es wichtig, eine Dosisabschätzung durchzuführen, da der Grad der Exposition einen wichtigen ersten Schritt bei der Bewältigung des Strahlenunfalls darstellt 1.

Bei großflächigen nuklearen oder radiologischen Notfällen kann die Anzahl der durchzuführenden Dosisabschätzungen je nach Größe des Unfalls zwischen einigen und Tausenden von Personen liegen3. In diesen Szenarien kann die physikalische Dosimetrie auch mehrdeutig sein (z. B. wenn das Dosimeter nicht ordnungsgemäß getragen wird) oder nicht verfügbar sein, wenn Mitglieder der Öffentlichkeit beteiligt sind. Während klinische Symptome für die Triage verwendet werden könnten, sind sie nicht unbedingt strahlenspezifisch und können zu einer falschen Diagnose führen. Daher ist es ratsam, die biologische Dosimetrie neben der physikalischen Dosimetrie und den klinischen Bewertungen zu verwenden. Diese Methode ermöglicht die Analyse strahlungsinduzierter Veränderungen auf zellulärer Ebene und ermöglicht die eindeutige Identifizierung exponierter Personen, die eine medizinische Behandlung benötigen4. Der Arzt kann diese biologische Dosisabschätzung dann verwenden, um physikalische Dosisrekonstruktionen und andere klinische Diagnosen zu ergänzen, um die geeignete medizinische Versorgung zu verschreiben5. Der Bedarf an biologischer Dosimetrie wird für die Triage und das medizinische Management von Opfern besonders hoch sein, wenn das Expositionsszenario nicht gut bekannt ist und wenn die Opfer Mitglieder der Öffentlichkeit sind. Der Hauptzweck der Triage besteht darin, “besorgte Gut”-Personen, die Prodromalsymptome haben könnten, aber keine hohe Dosis erhalten haben, effektiv von exponierten Personen zu unterscheiden, die sofortige medizinische Hilfe und spezialisierte Versorgung benötigen. Der Schwellenwert der Strahlendosis, der die Strahlenkrankheit verursachen kann, beträgt ca. 0,75 – 1,00 Gy. Dann haben diejenigen Personen, die > 2 Gy Exposition erhalten, ein höheres Risiko für ein akutes Strahlensyndrom und sollten umgehend medizinisch behandelt werden6,7. Rechtzeitige und genaue schätzungen der biologischen Dosis für Opfer, die im Kreuzfeuer solcher Katastrophen stehen, sind von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus kann es auch minimal exponierte Opfer trösten und beruhigen8.

Strahlenschutzbehörden verwenden verschiedene biodosimetrische Marker, die hauptsächlich auf dem Nachweis zytogenetischer Schäden wie dizentrischer Chromosomen oder Mikrokerne in kultivierten menschlichen Lymphozyten beruhen9. Der Nachweis zytogenetischer Schäden kann auch durch den Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsassay (FISH) Durchgeführt werden10. Der größte Nachteil der herkömmlichen zytogenetischen Methoden ist jedoch die lange Durchlaufzeit, um die Ergebnisse in einer Notfallsituation zu erhalten8.

Einer der frühesten Schritte im DNA-DSB-Erkennungsprozess ist die Phosphorylierung der Histonvariante H2AX, die zur Bildung von γ-H2AX und der anschließenden Rekrutierung von Reparaturfaktoren führt. In den letzten zehn Jahren hat der Nachweis von strahlungsinduzierten γ-H2AX-Herden in peripheren Blutlymphozyten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wachsende Aufmerksamkeit als zuverlässiges biologisches Dosimetriewerkzeugerhalten 11,12,13,14,15. Je nach Strahlungsqualität und Zelltyp wird die maximale Ausbeute an γ-H2AX-Herden innerhalb von 0,5 – 1 Stunde nach Bestrahlung detektiert16,17. Es wird erwartet, dass es eine enge Korrelation zwischen der Anzahl der DNA-DSB- und γ-H2AX-Brennpunkten sowie zwischen dem Verschwinden von Brennpunkten und der DSB-Reparatur gibt. Laserscherenexperimente mit einem gepulsten Lasermikrostrahl haben gezeigt, dass γ-H2AX-Brennpunkte an den Stellen der DNA DSB18 lokalisiertsind. Während es ein Thema der aktiven Debatte bleibt, schlug eine der frühesten Studien mit 125I eine Eins-zu-Eins-Korrelation zwischen der berechneten Anzahl von Desintegrationen pro Zelle (darstellbar für die Anzahl der strahlungsinduzierten DNA-DSB) und der Anzahl der γ-H2AX-Brennpunkte vor, diemit 19,20bewertet wurden.

In den letzten zehn Jahren hat die Europäische Union die Projekte MULTIBIODOSE (Multi-disciplinary biodosimetric tools to manage high scale radiological casualties) und RENEB (Realizing the European Network of Biodosimetry) finanziert, um ein nachhaltiges Netzwerk in der biologischen und retrospektiven Dosimetrie zu schaffen.21,22. An diesem Projekt waren verschiedene Labore in ganz Europa beteiligt, um die Notfallreaktionsfähigkeiten im Falle eines radiologischen Notfalls zu bewerten.14,21,22. Der γ-H2AX-Foci-Assay hat eine Reihe erheblicher Vorteile, wie z. B. eine schnelle Verarbeitungszeit, das Potenzial für die Batch-Verarbeitung, die einen hohen Durchsatz ermöglicht, sowie seine hohe Empfindlichkeit, wenn er innerhalb weniger Stunden nach der Exposition verwendet wird13,23,24. Die hohe Sensitivität des Assays im niedrigen Dosisbereich führte zu einer Reihe von Studien, in denen der γ-H2AX-Foci-Assay als Indikator für die Wirkung einer medizinischen Strahlenexposition sowohl in der Strahlentherapie als auch in diagnostischen Bildgebungsanwendungen verwendet wurde.25,26,27,28,29,30. Diese Eigenschaften machen den γ-H2AX-Foci-Assay zu einer äußerst wettbewerbsfähigen Alternative zu anderen Methoden zur frühzeitigen Triage bei großen nuklearen Unfällen, um kritisch exponierte personen von personen mit geringem Risiko zu trennen. Mehrere Optimierungsexperimente haben gezeigt, dass es möglich ist, den γ-H2AX-Foci-Assay mit kleinen Blutmengen durchzuführen, wie die Studie von Moquet et al., die berichteten, dass es möglich ist, den γ-H2AX-Foci-Assay mit nur einem Tropfen Blut (Fingerstich) durchzuführen.31. Ein ähnlicher Ansatz wurde bei der Entwicklung des vollautomatischen Hochdurchsatz-RABIT-Systems (Rapid Automated Biodosimetry Tool) verwendet, das für die Messung γ-H2AX-Ausbeuten aus Fingerstick-abgeleiteten Blutproben optimiert wurde.32,33. Insgesamt deuten die Ergebnisse der MULTIBIODOSE- und RENEB-Vergleichsstudien darauf hin, dass der γ-H2AX-Foci-Assay nach einer kürzlichen (bis zu 24 Stunden) akuten Strahlenexposition ein sehr nützliches Triage-Werkzeug sein könnte.12,13,14. In einer Vergleichsstudie mit niedrigem Dosisbereich konnte eine Dosis von nur 10 mGy von den scheinbestrahlten Kontrollproben unterschieden werden, was die Empfindlichkeit des Assays im niedrigen Dosisbereich unterstreicht.34. Es ist wichtig zu beachten, dass die hohe Sensitivität des Assays besonders für Lymphozyten gilt, was sie zu einem der am besten geeigneten Zelltypen für die Bewertung von niedrig dosierten Expositionen macht. Lymphozyten sind hauptsächlich nicht-zyklische Zellen und stellen eine synchrone Population dar. Letzteres vermeidet die Expression von γ-H2AX mit der DNA-Replikation assoziiert ist, was die Empfindlichkeit des Assays zum Nachweis von strahlungsinduziertem DSB während der G2- und S-Phase des Zellzyklus signifikant reduziert35. Zusätzlich zu seiner Empfindlichkeit gegenüber niedrigen Dosen für Lymphozyten ist die Durchlaufzeit des γ-H2AX-Foci-Assays signifikant schneller als zytogenetische Techniken wie der dizentrische und mikronukleöse Assay, da er keine Stimulation von Lymphozyten erfordert. Daher können Ergebnisse innerhalb weniger Stunden im Vergleich zu ein paar Tagen für zytogenetische Techniken erhalten werden. Ein großer Nachteil des Assays ist das schnelle Verschwinden des γ-H2AX-Foci-Signals, das normalerweise innerhalb von Tagen nach der Strahlenexposition auf den Ausgangswert reduziert wird, abhängig von der DNA-Reparaturkinetik36. Daher ist die am besten geeignete Anwendung des Assays in einem Biodosimetrie-Kontext für anfängliche Triage-Zwecke und um zeitaufwendigere zytogenetische biologische Dosimetrie-Follow-up für bestimmte Opfer zu priorisieren. Für eine präzise retrospektive Biodosimetrie und Langzeitwirkungen muss man sich jedoch auf zytogenetische Techniken wie dreifarbige FISH-Analysen zum Nachweis stabiler Chromosomenaberrationen verlassen, falls die Exposition vor einigen Jahren stattgefunden hat10.

Im Rahmen mehrerer Biodosimetrie-Initiativen wurden mehrere Assays für Triage-Zwecke neben dem γ-H2AX-Foci-Assay zur Triage von Menschen in groß angelegten radiologischen Notfällen evaluiert; wie der dizentrische Assay, der Zytokinese-Block-Mikronukleus-Assay, die Elektronenparamagnetresonanz (EPR), der Serumprotein-Assay (SPA), der Skin Speckle Assay (SSA), die optisch stimulierte Lumineszenz (OSL) sowie die Genexpressionsanalyse 37,38. Der γ-H2AX-Foci-Assay kann quantitativ zur Bewertung der DNA-DSB-Bildung und -Reparatur verwendet werden39. Der Assay ist jedoch zeitabhängig, da das Niveau der γ-H2AX-Brennpunkte aufgrund der DNA-DSB-Reparaturkinetik40mit der Zeit nach der Bestrahlung variiert. Eine vergleichende Studie zeigte, dass die mikroskopische Bewertung mit Z-Stage-Kapazität die genauesten Ergebnisse nach 1 Gy Bestrahlung liefert, während die Durchflusszytometrie nur bei höheren Dosen von IR41zuverlässige Ergebnisse liefert. Es gibt viele Berichte über die Entwicklung von Bildanalyselösungen für den Einsatz im automatisierten Scoring42,43,44,45,46. In diesem Protokoll wird eine automatisierte Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopieplattform verwendet, um γ-H2AX-Herde in peripheren Blutlymphozyten zu analysieren. Die Verwendung eines automatischen Scoring-Systems vermeidet sowohl Interlabor- als auch Inter-Observer-Scoring-Bias, während es immer noch genügend Empfindlichkeit ermöglicht, um Dosen unter 1 Gy47zu erkennen. Der Hauptvorteil dieses Systems gegenüber freier Open-Source-Software für foci scoring ist die Tatsache, dass der komplette Prozess vom Scannen der Dias bis zur Erfassung und Wertung automatisiert ist. Das Konzept der benutzerdefinierbaren und speicherbaren Klassifikatoren garantiert eine Reproduzierbarkeit, die den Ergebnissen einen unvoreingenommenen Grad an Qualität verleiht. Daher veranschaulicht diese Arbeit, wie γ-H2AX-Herdergebnisse mit einer automatisierten mikroskopischen Scan- und Scoring-Methode erhalten werden können, die verwendet werden kann, wenn Blutproben von potenziell überbelichteten Personen von Radiobiologielabors für biologische Dosimetriezwecke empfangen werden.

Protocol

Diese Studie wurde vom Biomedical Research Ethics Committee der University of Western Cape Ethics Committee – Code BM18/6/12 genehmigt. 1. Vorbereitung der Lösungen48 Zellfixierungslösung (3% PFA in PBS) Tragen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA) und arbeiten Sie in einem Abzug, fügen Sie 20 g Paraformaldehyd zu 200 ml destilliertemH2Ohinzu. Erhitzen Sie das Gemisch auf 60 °C, um die Auflösung zu erleichtern. Sobald sich das PFA aufgelöst hat, 40 Tropfen 5 N NaOH vorsichtig über 30 Minuten geben und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Mit 1 M HCl auf pH 7 einstellen und mit destilliertem H2 O auf ein Endvolumen von250mL auffüllen (Aliquots können 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden). Fügen Sie 25 ml aus dieser Lösung zu 41,7 ml PBS hinzu, um eine 3% ige PFA-Lösung zu erhalten. 1% ige Bovine Serum Albumin (BSA) Lösung: 10 g BSA zu 1000 ml PBS geben und mischen, bis sie gelöst sind. Bei 4 °C bis zum Gebrauch (maximal 72 Stunden) lagern. Triton-X-Lösung in einer Konzentration von 1:500: 1 μL Triton-X zu 500 μL PBS geben und bei 4 °C bis zur Verwendung (maximal 24 Stunden) lagern. Antikörper-Lösungen Primärer Antikörper – Anti-γ-H2AX in einer Konzentration von 1:500: 1 μL Anti-γ-H2AX zu 500 μL 1% iger BSA-Lösung geben, bei 4 °C bis zur Verwendung (maximal 24 Stunden) lagern. Sekundärer Antikörper – DAM-TRITC in einer Konzentration von 1:1000: 1 μL DAM-TRITC zu 1000 μL 1% BSA-Lösung geben und bei 4 °C bis zur Anwendung (maximal 24 Stunden) lagern. Komplette Medien des Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) Geben Sie gefiltertes fetales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin zu RPMI 1640-Medien in einer sterilen Flasche, um eine Endkonzentration von 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin zu erhalten. 2. Vorbereitung der Proben HINWEIS: Für dieses Protokoll werden periphere Vollblutproben durch Venenpunktion in Lithium-Heparin-Entnahmeröhrchen von gesunden erwachsenen Freiwilligen gesammelt (mit Einverständniserklärung – BM18/6/12 Biomedical Research Ethics Committee der Ethikkommission der University of Western Cape). Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass das Blut und das Dichtemedium von 1,077 g / ml an Raumtemperatur gewöhnt sind. Verdünnen Sie in einer vorbereiteten Biosicherheitswerkbank das periphere Vollblut in einem 1: 1-Volumen mit PBS und schichten Sie das verdünnte Blut vorsichtig auf einem gleichen Volumen zu zwei Volumen medium mit einer Dichte von 1,077 g / ml. Es ist wichtig, das Blut allmählich auf das Dichtemedium zu schichten, indem das Röhrchen um 45° geneigt gehalten wird, um sicherzustellen, dass sich Blut und Dichtemedium nicht vermischen. Die Suspension vorsichtig in eine Zentrifuge geben und 20 Minuten lang mit 900 x g drehen. Danach die “trübe” Schicht nur zu einem neuen sterilen konischen Röhrchen pipettieren und das Röhrchen mit PBS füllen und 10 Minuten bei 1000 x g zentrifugieren. Danach den Überstand mit einer Pipette absaugen, vorsichtig sein, um das Pellet nicht zu stören, das PBMC-Pellet vorsichtig in 1 ml PBS resuspendieren und das Rohr mit PBS füllen. Wiederholen Sie den obigen Waschschritt noch zwei weitere Male, um zu insgesamt drei Wäschen zu gelangen. Zählen Sie die Anzahl der PBMCs mit einem Hämozytometer, wissen Sie, dass jeder ml peripheres Blut von einem erwachsenen Spender zu einem groben Durchschnitt von 1 – 1,5 x 106 PBMCs49führt. Nach der Zählung verdünnen Sie das PBMC-Pellet auf eine Konzentration von 8 x 105 Lymphozyten in 1 ml cRPMI. Anschließend werden etwa 2 x 106 PBMCs oder 2,5 ml aus der isolierten PBMC-Lösung in ein steriles, konisches Röhrchen zur Bestrahlung gegeben. 3. Probenbestrahlungen ACHTUNG: Behandeln Sie die Bestrahlungseinheit gemäß den Strahlenschutzrichtlinien und tragen Sie jederzeit ein physikalisches Dosimeter. Stellen Sie sicher, dass das verwendete Bestrahlungssystem so kalibriert und eingerichtet ist, dass die richtigen erwarteten Dosen erreicht werden. Bestrahlen Sie PBMCs bei Raumtemperatur mit einer 60Co-Quelle. Kalibrieren (TRS-398-Protokoll) mit einer Farmer 117-Kammer, für die ein Kammerkalibrierungsfaktor vom National Metrology Institute of South Africa (NMISA)50erhalten wurde. Für diesen Assay platzieren Sie die konischen Röhrchen zwischen einer 5 mm Acrylplatte (die für den Strahleintritt verwendet wird) und 50 mm Rückstreumaterial mit der aktuellen 60Co-Quelldosisleistung von 0,57 Gy/min für eine 300 mm × 300 mm homogene Feldgröße bei 750 mm Quell-zu-Oberfläche-Abstand. Bestrahlen Sie die PBMCs mit abgestuften Dosen von 0,125, 0,500, 1,000, 1,500 und 2,000 Gy und halten Sie die scheinbestrahlten Kontrollproben im Kontrollraum, wobei sie nur der Umgebungsstrahlung ausgesetzt sind. Inkubieren Sie die bestrahlten Proben für 1 Stunde bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2-Inkubator, um die maximale Anzahl von γ-H2AX-Herden zu erreichen.HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Versuchsdesign geändert werden. 4. Folienvorbereitung HINWEIS: Siehe Abbildung 1 zur Folieneinrichtung. Bereiten Sie 3 Objektträger (technische Wiederholungen) mit Objektträgern vor, die mit einer positiv geladenen Oberfläche beschichtet sind, um die Haftung pro Bestrahlungsbedingung (oder pro konischem Rohr) zu verbessern. Legen Sie den Schlitten in den Cliphalter, fügen Sie die Filterkarte darauf und schließlich den Trichter hinzu. Befestigen Sie die Objektträgerclips und legen Sie sie in die Zytozentrifuge. 250 μL der Zellsuspension in den Trichter geben (200.000 Zellen/Objektträger) und 30 x g für 5 Minuten mit einer Zytozentrifuge drehen. Entfernen Sie nach der Zytozentrifugation den Objektträger aus dem Cliphalter und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis um die Stelle mit den Zellen, um den Immunfluoreszenzfleck während des Färbevorgangs auf den gebundenen Zellen zu erhalten. 5. Fixierung und Immunfluoreszenz γ-H2AX-Färbung HINWEIS: Alle Lösungen werden vorsichtig direkt auf den Zellbereich gegeben, der durch einen hydrophoben Kreis gekennzeichnet ist. Färbelösungen werden leicht über dem Objektträger abgegeben, ohne dass die Pipettenspitze die Zellen stören kann. Lösungen werden NICHT der gesamten Folie hinzugefügt. Fixieren Sie die Folien in frisch zubereiteten 3% PFA für 20 Minuten.HINWEIS: Die Objektträger können in PBS mit 0,5% PFA bei 4 °C für maximal 2 Tage gelagert werden, bevor eine Immunfärbung durchgeführt wird. Danach die Folien in einem Coplin-Glas mit PBS für 5 Minuten waschen und dann die Zellen 10 Minuten lang mit 100 μL der kalten Triton-X-Lösung bedecken, um eine Permeabilisierung zu ermöglichen. Kippen Sie die Triton-X-Lösung auf Seidenpapier und waschen Sie die Objektträger dreimal in 1% iger BSA-Lösung für 10 Minuten. Dies geschieht, um unerwünschte Hintergründe zu verhindern, indem die unspezifische Antikörperbindung blockiert wird. Inkubieren Sie Objektträger bei Raumtemperatur mit 100 μL des 1:500-verdünnten primären Anti-γ-H2AX-Antikörpers für 1 Stunde in einer Befeuchtungskammer, die leicht durch Hinzufügen von nassem Seidenpapier am Boden einer rechteckigen Objektträgeraufbewahrungsbox erreicht werden kann. Kippen Sie die Antikörperlösung auf Seidenpapier und führen Sie drei Wäschen mit 1% BSA-Lösung für 10 Minuten in einem Coplin-Glas durch, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen und eine unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu verhindern. Objektträger mit 100 μL der 1:1000-verdünnten sekundären DAM-TRITC-Antikörperlösung für 1 Stunde in der Befeuchtungskammer inkubieren. Kippen Sie die Antikörperlösung auf Seidenpapier und waschen Sie die Objektträger dreimal 10 Minuten lang in PBS. Trocknen Sie schließlich die Objektträger außerhalb des hydrophoben Kreises mit weichem, staubfreiem Seidenpapier und geben Sie 1-2 Tropfen DAPI in ein wässriges Montagemedium auf und bedecken Sie den Objektträger vorsichtig mit einem 24 x 50 mm Abdeckzettel, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind, und stellen Sie ihn über Nacht bei 4 ° C in den Kühlschrank. Dias können vor dem Scannen maximal 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. 6. Automatisiertes Scannen und Scoring von Dias HINWEIS: Das Scansystem muss über ein Fluoreszenzmikroskop, eine hochauflösende CCD-Kamera (Charged Coupled Device) verfügen, die an einen Framegrabber für die Echtzeitdigitalisierung von Videobildern angeschlossen ist, einen Scantisch, einen Trackball für manuelle Bewegungen, eine 3D-Maus, einen schnellen PC und Monitor sowie eine Festplatte für die Archivierung (Abbildung 2). Klassifikator-SetupHINWEIS: Der Klassifikator ist ein Satz von Parametern, die definieren, wie das System Zellen erkennt. Sie resultiert aus dem Training auf Basis vorklassifizierter Bildfelder. Ein Klassifikator ist spezifisch für die Vergrößerung, den Zelltyp und das Labor eines Mikroskops. Klassifikatoren können daher Änderungen der folgenden Parameter erfordern, um sie an die aktuellen Bedingungen anzupassen. Es wird empfohlen, die Einstellungen vor der Auswertung mit einer Referenzfolie zu testen. Bildaufnahme: Verwenden Sie ein 40-fach trockenes Objektiv für die Bildgebung. Um eine vergleichbare Bildqualität in allen Zellen zu erreichen, stellen Sie die Kameraintegrationszeit auf den Automatischen Modus. Stellen Sie die maximale Integrationszeit für beide Farbkanäle auf mindestens 1 Sekunde ein (Kameraverstärkung 4.0). Der Signalkanal wird mit 10 Fokusebenen und 14/40 μm zwischen den Ebenen erfasst. Zellselektion: PBMCs in einem Bereich von 20,00 μm2 und 76,00 μm2 werden detektiert. Legen Sie die maximale Konkavitätstiefe auf 0,05 und das maximale Seitenverhältnis auf 1,4 fest. Legen Sie den relativen Schwellenwert für die Graustufe auf 20 % fest. Zellverarbeitung: Verarbeiten Sie den DAPI-Counterstain-Kanal mit einem Histogramm-Maximum-Algorithmus, um den Hintergrund zu reduzieren. Der Signalkanal wird mit einem TopHat-Filter (Stärke 7, Glättungsfaktor 0) verarbeitet, um den Hintergrund zu reduzieren und die Signale zu verstärken. Signalzählung: Zählen Sie Die Brennpunkte mit der Objektanzahlfunktion des Geräts. Um eine falsch-positive Auswertung der verbleibenden Hintergrundsignale zu vermeiden, werden nur diejenigen Signale gezählt, die im Vergleich zum hellsten Objekt in der Zelle mindestens 30% der Intensität aufweisen. Legen Sie die Dias nach der sanften Reinigung mit 70% Ethanol auf die automatisierte Scanplattform oder den Diatisch, um Staub zu entfernen. Folieneinrichtung – Öffnen des Dialogfelds “Folieneinrichtung” (Abbildung 3) Wählen Sie den richtigen Datenpfadaus, um anzugeben, wo die aus der Suche resultierenden Foliendateien gespeichert werden. Geben Sie der Folie einen Namen, jede Folie muss einen eindeutigen Namen erhalten. Wenn eine Reihe von Folien in Form einer aufgezählten Liste eingegeben wird, kann das ‘?’ als Platzhalter für die Foliennummer verwendet werden. Wählen Sie den geeigneten Klassifikator aus, wie in Abschnitt 1.1 – 1.4 beschrieben (Abbildung 4). Wählen Sie das Suchfenster und dann Vordefiniert aus, wenn eine Suchfensterdefinition vorhanden ist, die dem Zytozentrifugenzellkreis entspricht, wählen Sie die entsprechende Definition in der Spalte Größe aus, oder wählen Sie Manuell aus, wenn keine vordefinierte Suchfensterdefinition verfügbar ist. In diesem Fall muss die Spalte Größe nicht festgelegt werden. Wählen Sie Maximale Zellzahl und fügen Sie die maximale Anzahl von Zellen hinzu, die gescannt werden müssen. Die Suche wird auch dann beendet, wenn das ausgewählte Suchfenster noch nicht vollständig gescannt wurde, sobald die Max Cell Count erreicht ist. Für Biodosimetrie-Anwendungen ist ein automatisiertes Scoring von 1000 Zellen pro Objektträger ausreichend, wenn man bedenkt, dass 3 Objektträger pro Blutprobe vorbereitet werden. Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen zu bestätigen. Einrichten des Folienscans Klicken Sie in der Seitenleiste auf die Schaltfläche Suchen. Wenn in der Folieneinrichtung die Einstellung Manuelles Suchfenster ausgewählt wurde, öffnet sich ein Dialog, der die Bestimmung des Scanbereichs ermöglicht (Abbildung 5). Wählen Sie mit dem 10-fachen Ziel interaktiv den rechteckigen Suchbereich auf der Folie aus, indem Sie per Linksklick zwei Ecken des Suchfeldes fixieren. Dies kann mit der OK-Taste bestätigt werden. Wenn das Suchfenster auf ein vordefiniertes Suchfenster verweist, entfällt dieser Schritt. Der Benutzer wird aufgefordert, eine Fokusstartposition anzupassen. Ein Referenzobjekt wird dann automatisch ausgewählt, die Software fordert den Benutzer auf, einen Referenzkern (mit dem 40-fachen Objektiv) für jede Folie zu fokussieren und zu zentrieren und die Einstellungen mit OKzu bestätigen. Das System wechselt automatisch nacheinander zu allen Folien. Passen Sie bei Bedarf Live Image Setup – Integration Time für diesen Schritt an ( Abbildung5). Überprüfen Sie alle Mikroskopeinstellungen und bestätigen Sie die Systemaufforderung mit OK. Das System startet den automatisierten Fokussier- und Scanvorgang. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, werden die Daten zur Analyse auf dem Computer gespeichert. Das Scansystem schaltet sich nach Abschluss des Scans automatisch ab.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich der Hebel des Mikroskopröhrchens in einer Position befindet, die das gesamte Licht zur Kamera ableitet. Suche beendet, die Suche wird beendet, wenn die gesamte Suche gescannt wurde, wenn die maximale Zellenanzahl erreicht wurde oder wenn die Suche abgebrochen wurde. FolienanalyseHINWEIS: Der abgeschlossene Scan ist in Abbildung 6 dargestellt. Wenn der Scan abgeschlossen ist, klicken Sie in der Seitenleiste auf die Schaltfläche Galerie. Überprüfen Sie die Galerie, die aus kleinen Bildern von erkannten Zellen besteht. Geben Sie in diesem Fenster (Abbildung 7) an, ob die im Katalog gespeicherten Zellen nach einem Kriterium aus einem Dropdown-Menü ausgewählt werden sollen. Zellen werden im Allgemeinen in der Reihenfolge angezeigt, in der sie erkannt wurden. Klicken Sie auf Qualitätshistogramm/Merkmalswertdiagramm (Abbildung 8), um die Verteilung des Qualitätsmaßes für die erkannten Zellen sowie die Mittelwerte und die Standardabweichung der bewerteten Brennpunkte anzugeben.

Representative Results

Für dieses Protokoll wurden humane periphere mononukleäre Blutzellen (PMBCs) aus Vollblut von vier gesunden erwachsenen Freiwilligen isoliert und Strahlendosen von 0,125, 0,250, 0,500, 1,000 und 2,000 Gy ausgesetzt. Danach wurden die Proben für 1 Stunde bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2-Inkubator inkubiert. Nach der Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung werden die Objektträger automatisch gescannt und bewertet. Die Abbildungen 6, 7 und 8 geben eine Darstellung dessen, was die Software an den Benutzer ausgibt. Nach Abschluss des Scans erscheint ein Analysefenster, das einen Überblick über die bewerteten Brennpunkte gibt. Die Galerie gibt alle Schwerpunkte mit einem interaktiven Menü, das Ausreißer löschen kann, und schließlich wird ein Histogramm mit einer detaillierten Datenzusammenfassung gegeben. Die γ-H2AX-Herde nach Einwirkung von γ-Strahlen sind in Abbildung 9 dargestellt. Es gab einen allmählichen Anstieg der Anzahl der γ-H2AX-Herde mit zunehmender Dosis. Diese Grafik veranschaulicht nicht nur die Dosisabhängigkeit und Sensitivität des Assays, sondern die Anpassung kann auch verwendet werden, um eine Dosisschätzung durchzuführen, wenn eine Probe von einer Person erhalten wird, die einer unbekannten Dosis ausgesetzt war. Es ist wichtig zu beachten, dass man für diese Person keine scheinbestrahlten Kontroll- oder Hintergrundschwerpunkte hat. Daher enthält Abbildung 9 den 0 Gy-Wert der scheinbestrahlten Kontrollproben, der 0,57 ± 0,23 Gy für die vier erwachsenen Spender in dieser Studie betrug. Abbildung 1: Vorbereitung von Objektträgern für die Zytozentrifugation. Legen Sie den Schlitten in den Cliphalter, fügen Sie die Filterkarte darauf und schließlich den Trichter hinzu. Befestigen Sie die Objektträgerclips und legen Sie sie in die Zytozentrifuge. Entfernen Sie nach der Zytozentrifugation den Objektträger aus dem Cliphalter und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Pen einen Kreis um die Stelle mit den Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Die automatisierte Scanplattform, die in diesem Protokoll verwendet wurde und einen automatisierten Scanner enthält, der an ein Fluoreszenzmikroskop angeschlossen ist. Abbildung 3: Menü für die Folieneinrichtung. Öffnen Sie den Dialog, indem Sie in der Seitenleiste auf die Schaltfläche SETUP klicken. Wählen oder geben Sie das Zielverzeichnis für die Ergebnisdateien ein Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4:Setup-Menü für den Klassifikator. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Klassifikatoreinstellungen mit dem aktuellen Zelltyp, den Vorbereitungsbedingungen und den Färbemustern der Probe übereinstimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Setup-Menü für manuelles Suchfenster. Fenster wurde in der Folieneinrichtung ausgewählt; Es öffnet sich ein Dialog, der die Bestimmung des Scanbereichs ermöglicht. Mit dem 10-fachen Ziel wird der rechteckige Suchbereich auf der Folie interaktiv ausgewählt, indem zwei Ecken des Suchfeldes per Linksklick fixiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Analysefenster: Sobald der Scan abgeschlossen ist, zeigt das Analysefenster die Ergebnisse des Scans an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7:Galerieansicht für die ausgewählte Folie. Die Registerkarte Galerie befindet sich in der Seitenleiste. Die Bildergalerie besteht aus kleinen Bildern der erkannten Zellen, die als kombiniertes DAPI-TRITC-Bild angezeigt werden. In der unteren linken und rechten Ecke jedes Bildes werden die direkte Brennpunktzahl und die korrigierten Brennpunktzahlen angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8: Histogrammbilder für die ausgewählte Folie. Dieses Fenster wird durch Klicken mit der rechten Maustaste auf das Histogramm geöffnet. Mit einem Klick auf das Histogramm liefert das Histogramm-Tab-Blatt eine Datenzusammenfassung, die den Mittelwert, die Standardabweichung, den Variationskoeffizienten, die Minimal-, Maximal- und Medianwerte der analysierten Zellen auflistet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9: Anzahl der γ-H2AX-Herde in Abhängigkeit von der Dosis für Lymphozyten, die 60Co-γ-Strahlen ausgesetzt waren. Die Fehlerbalken sind die Standardabweichungen, die die interindividuelle Variation zwischen den Spendern darstellen. Die Daten stellen die mittlere Anzahl der γ-H2AX-Brennpunkte ± Standardabweichung von vier gesunden Freiwilligen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein schrittweises Verfahren für das automatisierte fluoreszenzmikroskopiebasierte Scoring des γ-H2AX-Foci-Assays. Es veranschaulicht den Nutzen des Foci-Assays als zeiteffiziente Methode zur Analyse der Anzahl der strahleninduzierten DNA-DSB in peripheren Blutlymphozyten zur Durchführung einer biologischen Dosisbewertung in einem Strahlenunfallszenario, in dem Personen unbekannten IR-Werten ausgesetzt sein könnten.

In diesem spezifischen Protokoll wurden PBMCs in vitro bestrahlt, um eine In-vivo-Strahlenexposition nachzuahmen. Sobald die Bestrahlung und die Inkubationszeit von einer Stunde abgeschlossen sind, werden Objektträger mit einer Zytozentrifuge hergestellt, um einen Konzentrationspunkt von Zellen auf dem Objektträger zu erzeugen. Die Verwendung einer Zytozentrifuge ist unerlässlich, um standardisierte Bedingungen für das automatisierte Scoring zu erreichen. Nach Fertigstellung wird ein hydrophober Pen verwendet, um einen Kreis um die Zellen zu ziehen, um die Verschwendung von Reagenzien zu reduzieren, indem der Benutzer die Färbereagenzien lokalisieren kann. Diese Art von Pen kann in verschiedenen Immunfärbungstechniken wie Paraffinschnitten, gefrorenen Abschnitten und zytologischen Präparaten verwendet werden. Darüber hinaus ist es wichtig, einen hydrophoben Pen auszuwählen, der mit Enzym- und Fluoreszenz-basierten Detektionssystemen kompatibel ist. Nach der Objektträgervorbereitung erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenz γ-H2AX-Färbung. In diesem Protokoll werden die Zellen mit 3% PFA in einer PBS-Lösung für 20 Minuten fixiert. Damit die Immunfärbung gelingt, ist es wichtig, dass die Morphologie der Zellen erhalten bleibt und dass die Antigenstellen für die verwendeten Nachweisreagenzien zugänglich sind. PFA ist ein relativ schonendes Mittel zur Fixierung und stabilisiert Zellen unter Erhalt von Proteinstrukturen51. Optimierungsexperimente mit höheren PFA-Konzentrationen und längeren Fixierungszeiten führten zu einem negativen Einfluss auf die Objektträgerqualität, aber eine weitere Lagerung (über Nacht) in 0,5% PFA bis zu 24 Stunden ergab gute Ergebnisse.

Der primäre, monoklonale 2F3-Antikörper, der in diesem Protokoll verwendet wird, reagiert auf die Histonvariante H2AX, wenn er bei Serin 139 nach DNA-DSB-Induktion phosphoryliert wird. Der Antikörper ist in der Lage, an den phosphorylierten Rest ohne Kreuzreaktivität mit anderen phosphorylierten Histonen zu binden52. Da es sich um einen primären monoklonalen Maus-Antikörper handelt, wurde ein sekundärer Antikörper gegen die Wirtsspezies des primären Antikörpers ausgewählt, während er in einem alternativen Wirt, nämlich Donkey-Anti-Mouse (DAM)-TRITC, aufgezogen wurde. Während die Immunfluoreszenzfärbung auf einer spezifischen Antikörper-Epitop-Bindung basiert, können mehrere intermolekulare Kräfte auch zu einer unspezifischen Hintergrundfärbung führen. Um die unspezifische Bindung zu reduzieren, ist es wichtig, ein blockierendes Reagenz in immunfluoreszierenden Färbeprotokollen53zu verwenden; Wir haben eine BSA-Lösung verwendet. Darüber hinaus sollte diesem Blockierungsschritt ausreichend Zeit eingeräumt werden, indem die Objektträger vor der primären und sekundären Antikörperfärbung mindestens 20 Minuten in der Lösung belassen werden. Darüber hinaus sollte die BSA-Lösung auch als Verdünnungsmittel für die primären und sekundären Antikörper verwendet werden. Abhängig von der Anti-γ-H2AX und dem sekundären Antikörper, der für die Färbung verwendet wird, sollte man erwägen, verschiedene Antikörperverdünnungen zu testen, um die optimale Konzentration zu bestimmen. Für eine präzisere Bewertung kann eine Doppelfärbung durchgeführt werden, indem zusätzliche DNA-DSB-Reparaturprotein-Antikörper hinzugefügt werden.

Ein großer Nachteil dieser Art der Analyse ist die Notwendigkeit, Blutproben so schnell wie möglich nach der Exposition zu entnehmen, da bekannt ist, dass die maximale Anzahl von Herden innerhalb von 48 Stunden nach der Bestrahlung wieder auf ein normales Niveau abnimmt. Wenn der Zeitpunkt des Strahlenunfalls und der anschließenden Blutentnahme bekannt ist, könnte es daher sinnvoll sein, mit verschiedenen Kalibrierkurven zu arbeiten, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der In-vitro-Bestrahlung (z. B. 4, 8, 12 und 24 Stunden) erstellt wurden. Wie jedoch bereits im Einleitungsabschnitt des Manuskripts erwähnt, liegt die Stärke des γ-H2AX-Foci-Assays in anfänglichen, schnellen Triage-Zwecken und sollte verwendet werden, um die zeitaufwendigere zytogenetische biologische Dosimetrie zu priorisieren. Ein kombiniertes Szenario, in dem mehrere Biodosimetrie-Biomarker parallel verwendet werden, wird die zuverlässigste Dosisabschätzung generieren und verschiedene Biodosimetrie-Labore weltweit haben sich zusammengeschlossen, um landesweite Netzwerke aufzubauen, die aktiviert und verwendet werden können, um mehrere, parallele Biodosimetrie-Bewertungen durch Labore mit unterschiedlichen Fachkenntnissen zu ermöglichen37,54,55 . Darüber hinaus laufen Entwicklungen für superschnelle Analysen wie ein mobiles Labor an oder in der Nähe der Unfallstelle56. Ständig werden neue, vielversprechende Biodosimetrie-Methoden entwickelt, die hoffentlich in Zukunft zu einem noch schnelleren und zuverlässigeren Durchsatz führenwerden 57.

Für das automatisierte Bildanalysesystem werden Dias eingelegt oder auf der automatisierten Scanplattform oder Diabühne platziert. Benennen und speichern Sie anschließend die Foliendetails im entsprechenden Ordner auf dem angeschlossenen Computer. Für dieses Experiment basiert die automatisierte Keim- und Herdedetektion auf den jeweiligen Klassifikatoreinstellungen. Stellen Sie beim Erstellen eines Klassifikators sicher, dass die ausgewählten Klassifikatoreinstellungen mit dem aktuellen Zelltyp, den Vorbereitungsbedingungen und der Immunfluoreszenzfärbung der Probe übereinstimmen. Im Klassifikator werden geeignete Fluoreszenzkanäle eingestellt, die dem Anregungsspektrum der primären und sekundären Antikörper entsprechen. Der Klassifikator ermöglicht bei Bedarf die Einstellung zusätzlicher Scoring-Parameter (z. B. Kerngröße, Fluoreszenzintensität, wie in Abschnitt 6.1 beschrieben). Werden zwei oder mehr DNA-Reparaturproteine (z.B. γ-H2AX und 53BP1) in einem Experiment kombiniert, ist das System auch in der Lage, Kolokalisationen von Signalen nachzuweisen. Zunächst erfasst das System DAPI-Bilder, wendet Bildverarbeitung an und identifiziert Kerne anhand morphologischer Kriterien, die im Klassifikator festgelegt sind. Die TRITC-Signale werden über 10 Z-Stacks mit einer Schrittweite von 0,35 mm zwischen den Brennebenen47erfasst. Der Klassifikator verwendete die Direct Foci Count, bei der die Anzahl der verschiedenen TRITC-Signale innerhalb des Kerns bewertet wird. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass mit zunehmender Strahlendosis Herdesignale dazu neigen, zu größeren Objekten zu verschmelzen, was zu einer Unterschätzung der tatsächlichen Herdezahl führt, wenn Objekte direkt gezählt werden. Es war für die hier beschriebene Analyse nicht erforderlich, aber ein zusätzlicher Schritt mit Corrected Foci Count kann implementiert werden, um dieses Problem zu lösen. Letzteres ermöglicht es dem System, die Größen der erkannten Signale zu erhalten und diese entsprechend zu wiegen. Die Verwendung beider Zählmethoden kann eine realistischere Schätzung der tatsächlichen Anzahl der Herde bei höheren Dosen liefern.

Um mit dem automatisierten Scannen zu beginnen, wird der Scanbereich bestimmt, indem mit dem 10-fachen Objektiv des Mikroskops ein rechteckiger Suchbereich erstellt wird, indem zwei Ecken des Suchfelds per Linksklick (Abbildung 5), gefolgt von der Fokussierung der Startposition. Das Referenzobjekt wird automatisch ausgewählt, und die Software fordert den Benutzer auf, für jede Folie einen Referenzkern (mit dem 40-fachen Objektiv) zu fokussieren und zu zentrieren. Nachdem die Suche begonnen hat, bewegt sich das System in die Mitte des Suchfensters der ersten ausgewählten Folie und fordert sie auf, das Referenzobjekt zu zentrieren und zu fokussieren. Dieses Objekt wird später als Positionsreferenz verwendet, um jede Verschiebung der Zellenpositionen zu korrigieren. Der zweite Zweck des Referenzfeldes ist die automatische Lichtanpassung, im Durchlichtmodus wird das Licht so lange eingestellt, bis das optimale Lichtniveau erreicht ist. Im Fluoreszenzmodus ist das Lichtniveau festgelegt, aber die Integrationszeit der CCD-Kamera kann erhöht werden, bis das erforderliche Signal gemessen wird. Um eine korrekte Lichteinstellung zu ermöglichen, sollte die Referenz Objekte mit typischer Färbung enthalten. Es ist wichtig, kein Feld zu verwenden, das Artefakte mit sehr hoher Färbeintensität aufweist. Nach der Lichteinstellung startet das System den Gitter-Autofokus an der Rasterposition, die dem Referenzfeld am nächsten liegt. Es fokussiert weiterhin Felder auf einem regelmäßigen Raster und bewegt sich in einem Mäander nach vorne und hinten zum Suchfenster. Der Scanvorgang beginnt, wenn der Raster-Autofokus abgeschlossen ist. Die Bühne wird in einem MäandermusterFeld nach Feld bewegt, um Daten zu erfassen. Wenn eine Zelle erkannt wird, werden ihre Position und ihr Galeriebild gespeichert und auf dem Bildschirm angezeigt, und die Zellenanzahl wird aktualisiert. Tritt ein Mikroskop-, Tisch- oder Feederfehler auf, wird die Suche automatisch abgebrochen. Der einzige Schritt, bei dem der Bediener manuell eingreift, ist während der Einrichtung des Dia-Scannens. Dies ist auch der Punkt, an dem eine schnelle Qualitätskontrolle stattfindet (Luftblasen, niedrige Zellzahlen, Verblassen der fluoreszierenden Signalfärbeartefakte) und wo entschieden werden kann, das Scannen eines Objektträgers von minderer Qualität abzubrechen. Eine Suche wird beendet, wenn die gesamte Folie gescannt wurde, wenn die maximale Zellenanzahl erreicht wurde oder wenn die Suche abgebrochen wurde. Sobald der Scan abgeschlossen ist, werden die Daten wie in Abbildung 6. Um gescannte Zellen anzuzeigen, wird das Galeriefenster geöffnet, und jede Zelle kann angezeigt werden (Abbildung 7). Dies ist ein weiterer Punkt, an dem der Bediener eine Qualitätskontrolle durchführen kann, indem er den Fokus der Galeriebilder und die Gesamtzahl der bewerteten Zellen überprüft. Wenn zu viele Zellen unscharf sind oder zu wenig Zellen vom System erkannt wurden, um eine realistische Dosisschätzung vorzunehmen (z. B. 100 Zellen anstelle der beabsichtigten 1000 Zellen), sollte die Entscheidung getroffen werden, den Objektträger und die automatische Punktzahl von der endgültigen Bewertung auszuschließen. Alle Daten sind in Histogrammen zusammengefasst (Abbildung 8), zusammen mit Informationen über die Verteilung, die Mittelwerte und die Standardabweichung der für jede Zelle bewerteten Brennpunkte. Die Histogramme können auch verwendet werden, um Subpopulationen von Kernen basierend auf den automatisierten Befunden zur Überprüfung auszuwählen und anzuzeigen. Statistische Analysen der Ergebnisse werden durchgeführt, nachdem die Verteilung, der Mittelwert und die Standardabweichung der Anzahl der Herde pro Zelle manuell erfasst wurden. Die Grafik kann als Kalibrierkurve für eine Dosisschätzung einer Biodosimetrieprobe verwendet werden. Dies kann unter Verwendung der Gleichung der Trendlinie erfolgen, um eine ungefähre Schätzung der erhaltenen Dosis vorzunehmen. Überdies Abbildung 9 zeigt, dass das automatisierte Scannen empfindlich genug ist, um bei niedrigen Dosen induzierte Herde zu erkennen. Weiterhin zeigen die Ergebnisse einen deutlichen linearen Anstieg der Anzahl der Herde pro Zelle mit Dosis. Es sollte beachtet werden, dass die Ergebnisse nur für den verwendeten Klassifikator repräsentativ sind, die Ergebnisse unterscheiden sich für verschiedene Klassifikatorparameter. Daher ist es im Falle einer biodosimetrischen Analyse wichtig, dass für die Biodosimetrieproben derselbe Klassifikator und die gleiche Objektträgervorbereitung verwendet werden wie diejenigen, die zur Erstellung der Kalibrierkurve verwendet wurden, die zur Durchführung der Dosisabschätzung verwendet wird. Obwohl es außerhalb des Umfangs dieser Studie lag, ist es wichtig zu beachten, dass der γ-H2AX-Foci-Assay auch zur Bestimmung von Teilkörperbestrahlungen verwendet werden kann. Die meisten unbeabsichtigten Strahlenexpositionen sind inhomogene oder Teilkörperexpositionen, bei denen nur eine lokalisierte Körperregion eine hochdosierte Exposition erhielt. Mehrere Studien zeigten, dass es möglich ist, den γ-H2AX-Foci-Assay zu verwenden, um den Anteil des körpers, der bestrahlt wurde, und die Dosis für die bestrahlte Fraktion abzuschätzen.42. Wenn eine Ganzkörperbestrahlung stattfindet, wird es eine zufällige Induktion von DNA-DSB in allen Zellen geben und man kann erwarten, eine Poisson-Verteilung zu finden. Ähnlich wie bei zytogenetischen Methoden, bei denen die Induktion von Chromosomenaberrationen tendenziell in peripheren Blutlymphozyten überdispergiert ist, wo es eine hohe Häufigkeit von Zellen mit multiplen Aberrationen und Zellen mit normalen Metaphasen gibt, schlägt die Dispersionsanalyse von γ-H2AX-Herden unter Verwendung einer kontaminierten Poisson-Methode über dispergierte Herdeverteilungen vor58. Letzteres wurde auch in in vivo Experimente mit Minipigs und einem Rhesusaffen59.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den Studienteilnehmern für ihre Blutspenden sowie Nurse V. Prince für die Blutprobenentnahme. Die finanzielle Unterstützung der South African National Research Foundation (NRF) für diese Forschung wird hiermit anerkannt. Die geäußerten Meinungen und die daraus gezogenen Schlussfolgerungen sind die der Autoren und sind nicht unbedingt dem NRF zuzuschreiben. Diese Arbeit wurde von der Internationalen Atomenergiebehörde (IAEO) im Rahmen eines Projekts der technischen Zusammenarbeit (Nummer: URU6042) zur Unterstützung von W. Martínez-López sowie des koordinierten Forschungsprojekts E35010 (Vertragsnummer: 22248) finanziell unterstützt.

Materials

Bovine serum albumin – BSA Merck A3059
Coplin Jar Sigma S6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm) Lasec Glass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL) WhiteSci 607101
Cytospin Healthcare Technologies JC370-12-L
Cytospin Clips Healthcare Technologies JC302
Cytospin filter cards Healthcare Technologies JC307
Cytospin Funnels Healthcare Technologies JC372
DAM-TRITC Invitrogen A16022
DAPI-Fluroshield Sigma/Merck F6057
Ethanol Kimix ETD901
Filter tips WhiteSci  200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HCl Merck
Histopaque Sigma/Merck 10771
lithium–heparin collection tubes The Scientific Group 367526
MetaSystems – Metafer Metasystems Azio Imager Z2: 195-041848
NaOH Merck 221465
NovoPen Leica Biosystems NCL-PEN
Paraformaldehyde Sigma/Merck 158127
Phosphate-buffered saline Tablets Separations SH30028,02
Pipettes WhiteSci P11037 and P1033 X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody Biolegend 613402 / 100 μg
RPMI medium WhiteSci BE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9) Sigma/Merck T-9284
Tubes (15ml) WhiteSci 601002
X-Tra adhesive slides – corner clipped SMM Technologies 3800200E
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– Automated Microscopic Scoring- γ-H2AX Foci Assay- Human Peripheral Blood Lymphocytes- Ionizing Radiation- DNA Double-strand Breaks- H2AX Phosphorylation- Automated Slide Scanning- Fluorescent Microscopy- Lymphocyte Isolation- Density Gradient Centrifugation- Gamma Irradiation- Cytocentrifugation- Standardized Slide Preparation

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Nair, S., Cairncross, S., Miles, X., Engelbrecht, M., du Plessis, P., Bolcaen, J., Fisher, R., Ndimba, R., Cunningham, C., Martínez-López, W., Schunck, C., Vandevoorde, C. An Automated Microscopic Scoring Method for the γ-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes. J. Vis. Exp. (178), e62623, doi:10.3791/62623 (2021).
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