טכניקות טיפול להפחתת מתח בעכברים
Summary
מאמר זה מתאר טכניקת טיפול בעכברים, טכניקת הטיפול בתלת-ממד, המאפשרת טיפול שגרתי על ידי הפחתת התנהגויות דמויות חרדה ומציגה פרטים על שתי טכניקות קשורות קיימות (טיפול במנהרה וזנב).
Abstract
חיות מעבדה נתונות למניפולציות מרובות על ידי מדענים או ספקי טיפול בבעלי חיים. הלחץ זה גורם יכול להיות השפעות עמוקות על רווחת בעלי חיים והוא יכול גם להיות גורם מבלבל עבור משתנים ניסיוניים כגון צעדי חרדה. במהלך השנים פותחו טכניקות טיפול הממזערות את הלחץ הקשור לטיפול עם דגש מיוחד על חולדות, ותשומת לב מועטה לעכברים. עם זאת, הוכח כי עכברים יכולים להיות מורגלים מניפולציות באמצעות טכניקות טיפול. התרגלות עכברים לטיפול מפחיתה את הלחץ, מקלה על טיפול שגרתי, משפרת את רווחת בעלי החיים, מפחיתה את השתנות הנתונים ומשפרת את האמינות הניסיונית. למרות ההשפעות המועילות של הטיפול, הגישה לאיסוף זנב, שהיא מלחיצה במיוחד, עדיין נמצאת בשימוש נרחב. מאמר זה מספק תיאור מפורט והדגמה של טכניקה חדשה לטיפול בעכבר שנועדה למזער את הלחץ שחוותה החיה במהלך אינטראקציה אנושית. טכניקה ידנית זו מבוצעת במשך 3 ימים (טכניקה לטיפול בתלת-ממד) ומתמקדת ביכולתו של בעל החיים להרגיל את הנסיין. מחקר זה מראה גם את ההשפעה של טכניקות טיפול במנהרות שהוקמו בעבר (באמצעות מנהרת פוליקרבונט) וטכניקת איסוף הזנב. נחקרו במיוחד הם ההשפעות שלהם על התנהגויות דמויי חרדה, באמצעות בדיקות התנהגותיות (מבוך גבוה פלוס והאכלה מדוכאת חידוש), אינטראקציה מרצון עם ניסויים ומדידה פיזיולוגית (רמות קורטיקוסטרון). טכניקת הטיפול בתלת-ממד וטכניקת הטיפול במנהרות הפחיתו פנוטיפים דמויי חרדה. בניסוי הראשון, באמצעות עכברים זכרים בני 6 חודשים, טכניקת הטיפול בתלת-ממד שיפרה באופן משמעותי את אינטראקציית הנסיין. בניסוי השני, באמצעות נקבה בת חודשיים וחצי, היא הפחיתה את רמות הקורטיקוסטרון. ככזה, טיפול בתלת-ממד הוא גישה שימושית בתרחישים שבהם נדרשת אינטראקציה עם הנסיין או מועדפת, או כאשר טיפול במנהרות עשוי שלא להיות אפשרי במהלך הניסוי.
Introduction
עכברים וחולדות הם נכסים חיוניים למחקרים פרה-קליניים1,2 למטרות מרובות, כולל אנדוקרינלית, פיזיולוגית, מחקרים פרמקולוגיים או התנהגותיים2. מהמספר ההולך וגדל של מחקרים הקשורים בבעלי חיים, עלה כי משתנים סביבתיים בלתי מבוקרים כולל אינטראקציה אנושית משפיעים על תוצאות שונות במחקר ביו-רפואי3,4,5. זה אחראי על שונות משמעותית שנצפו על פני ניסויים ומעבדות מחקר4,5, מהווה אזהרה גדולה במחקר בבעלי חיים.
גישות שונות יושמו במטרה להגביל את ההשפעה של גורמי לחץ סביבתיים והפחתת התגובה לאינטראקציה האנושית. לדוגמה, כדי להגביל את ההשפעה של גורמי לחץ סביבתיים, סטנדרטיזציה של תנאי הדיור ומערכות דיור אוטומטיות6,7 יושמו במעבדות. לגבי אינטראקציה עם בני אדם, גישות נפוצות לטיפול והובלת בעלי חיים לא התייחסו כלל לאי נוחות ומתח של בעלי חיים. לדוגמה, איסוף בעלי חיים בזנבם או באמצעות מלקחיים8 מגביר את החרדה הבסיסית9,10,11, מפחית את המחקר9,12 ותורם רבות לשונות בין אינדיבידואלית בתוך ומרחב מחקרים13,14. כתוצאה מכך, פותחו גישות אחרות, כגון טכניקת הטיפול בכוס, החלה על עכברים וחולדות. בגישה זו, בעלי החיים מכוסים מהכלוב שלהם, ומוחזקים על ידי הנסיינים עם ידיהם ויוצרים9,10,11. חלופה שימושית נוספת לטיפול בזנב כוללת שימוש במנהרת פוליקרבונט להעברת עכברים9,10,15. גישה זו מבטלת אינטראקציה ישירה בין העכבר לבין הנסיין. הן גישות הגביע והן גישות המנהרה הראו יעילות בהפחתת התנהגויות דמויי חרדה ופחד מהנסיין שניתן להגזים על ידי טכניקות טיפול מרתיעות, כגון איסוף זנב / טיפול בזנב9,10.
לכן, הגדלת הראיות מדגימה את התועלת של טיפול נכון בעכבר להפחתת השונות בין אנשים9,11, ושיפור רווחת בעלי החיים10. עם זאת, הטכניקות שהוזכרו לעיל עדיין מתמודדות עם מגבלות. טכניקת הטיפול בגביע יושמה עם לוחות זמנים הנעים בין 10 ימים (10 מפגשים על פני שבועיים16) עד 15 שבועות17, וזה כמות ניכרת של זמן עבור צוות המתקן והנסיינים. בנוסף, האפקטיביות של טיפול בכוס משתנה על ידיזן 9 וטיפול כוסות קונבנציונאלי בידיים פתוחות עלול להוביל עכברים נאיביים או זנים קופצים במיוחד לקפוץ מהיד9,18. טיפול במנהרות מביא לתוצאות עקביות יותר ובדרך כלל מהירות יותר בעדינות19. מנהרות משמשות גם כהעשרת כלוב ביתי. הם עוזרים לבעלי חיים להרגל להתמודד במהירות ומספקים את היתרונות הנוספים של העשרה. עם זאת, לטיפול במנהרות יש מגבלות בעת העברת בעלי חיים בין מכשירים. מעניין, הרסט ומערב9, והנדרסון ואח’20 הוכיח כי באמצעות טיפול ידני עדין וקצר כדי להעביר בעלי חיים מהמנהרה למנגנון אינו משפיע על הפנוטיפ שלהם.
כדי לספק חלופה לשיטות קיימות, עם הרגל בר השגה בפרק זמן קצר, מאמר זה מתאר טכניקה חדשנית המתרחבת על טכניקת הטיפול בגביע, ולכן אינה דורשת ציוד מסוים. גישה זו משתמשת באבני דרך כדי לאמוד את רמת הנוחות שיש לעכברים בתהליך הטיפול. הוא מראה יעילות בהפחתת תגובתיות העכבר ומתח (ברמות ההתנהגותיות וההורמונליות), מקל על טיפול שגרתי ותורם להפחתת השונות בין בעלי החיים. פרטים על טכניקה זו מסופקים כאן, ויעילותה בהפחתת התנהגויות דמויות חרדה, שיפור האינטראקציה עם הנסיינים והגבלת שחרור הורמון הלחץ ההיקפי (קורטיקוסטרון) מוצגים בשני מחקרים נפרדים (עכברים זכרים ונקביים), בהשוואה לטיפול במנהרות (שליטה חיובית) וטכניקות טיפול בזנב (שליטה שלילית).
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה ופיתוח השיטה מבוססים על התצפית כי טיפול בטכניקות בעכברים עדיין מתעלמים על ידי הקהילה המדעית, וכי מעבדות מסוימות עדיין מסרבות ליישם הרגלה או טיפול בטכניקות כדי להפחית את הלחץ והתגובה של בעלי החיים שלהם לפני ניסויים. בעוד המייצג מחויבות זמן, טיפול בבעלי חיים מספק השפעות מועילות לבע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לוועדה לטיפול בבעלי חיים של CAMH על תמיכתם בעבודה זו, כמו גם למטפלים בבעלי חיים של CAMH שסיפקו משוב נרחב על התועלת של ההליך, המניעים את ביצוע הניסויים המתוארים והגשת הפרוטוקול המפורט למשתמשים אחרים. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי CAMH BreakThrough Challenge, שהוענק ל- TP, ועל ידי כספים פנימיים מ- CAMH.
Materials
| 23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. | BD | 2546-CABD305145 | Needles for Blood collection |
| BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk | BD | 367841 | EDTA Coated tubes for blood collection |
| Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding | Bed-O-Cobs | BEDO1/4 | Novel bedding for novelty suppressed feeding |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5424 R | For centrifugation of blood. |
| Corticosterone ELISA Kit | Arbor Assays | K003-H1W | |
| Digital Camera | Panasonic | HC-V770 | Camera to record EPM/Experimenter interactions |
| Elevated Plus Maze | Home Made | n/a | Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor |
| Ethanol | Medstore House Brand | 39753-P016-EA95 | Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning |
| Ethovision XT 15 | Noldus | n/a | Automated animal tracking software |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Memory Card | Kingstone Technology | SDA3/64GB | For video recording and file transfer |
| Novelty Suppressed Feeding Chamber | Home Made | n/a | Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall . |
| Parlycarbonate tubes | Home Made | n/a | 13 cm in length and 5cm in diameter |
| Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding | Purina | n/a | Standard Bedding |
| Spectrophotometer | Biotek | Epoch Microplate Reader |
References
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
- Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
- Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
- Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
- Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
- Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
- Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
- Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
- Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
- Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
- Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
- LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
- Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
- Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures – a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
- Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
- Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can’t we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
- Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
- Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).
