Summary

Técnicas de manuseio para reduzir o estresse em camundongos

Published: September 25, 2021
doi:

Summary

Este artigo descreve uma técnica de manuseio em camundongos, a técnica de manuseio 3D, que facilita o manuseio rotineiro reduzindo comportamentos semelhantes à ansiedade e apresenta detalhes sobre duas técnicas relacionadas existentes (manuseio de túneis e caudas).

Abstract

Animais de laboratório são submetidos a múltiplas manipulações por cientistas ou prestadores de cuidados com animais. O estresse que isso causa pode ter efeitos profundos no bem-estar animal e também pode ser um fator de confusão para variáveis experimentais, como medidas de ansiedade. Ao longo dos anos, técnicas de manuseio que minimizam o estresse relacionado ao manuseio foram desenvolvidas com um foco especial em ratos, e pouca atenção aos ratos. No entanto, foi demonstrado que os ratos podem ser habituados a manipulações usando técnicas de manuseio. Habituar camundongos ao manuseio reduz o estresse, facilita o manuseio de rotina, melhora o bem-estar animal, diminui a variabilidade dos dados e melhora a confiabilidade experimental. Apesar dos efeitos benéficos do manuseio, a abordagem de captação de cauda, que é particularmente estressante, ainda é amplamente utilizada. Este artigo fornece uma descrição detalhada e demonstração de uma técnica recém-desenvolvida de manuseio de camundongos destinada a minimizar o estresse experimentado pelo animal durante a interação humana. Esta técnica manual é realizada ao longo de 3 dias (técnica de manuseio 3D) e foca na capacidade do animal de habituar ao experimentador. Este estudo também mostra o efeito das técnicas previamente estabelecidas de manuseio de túneis (usando um túnel de policarbonato) e da técnica de captação de cauda. Especificamente estudados são seus efeitos sobre comportamentos semelhantes à ansiedade, usando testes comportamentais (Elevated-Plus Maze e Novelty Suppressed Feeding), interação voluntária com experimentadores e medição fisiológica (níveis de corticosterona). A técnica de manuseio 3D e a técnica de manuseio do túnel reduziram fenótipos semelhantes à ansiedade. No primeiro experimento, usando camundongos machos de 6 meses de idade, a técnica de manuseio 3D melhorou significativamente a interação dos experimentadores. No segundo experimento, usando fêmea de 2,5 meses, reduziu os níveis de corticosterona. Como tal, o manuseio 3D é uma abordagem útil em cenários onde a interação com o experimentador é necessária ou preferida, ou onde o manuseio do túnel pode não ser possível durante o experimento.

Introduction

Camundongos e ratos são ativos essenciais para estudos pré-clínicos1,2 para múltiplos fins, incluindo estudos endocrinas, fisiológicos, farmacológicos ou comportamentais2. A partir do crescente número de estudos envolvendo animais, surgiu que variáveis ambientais descontroladas, incluindo a interação humana, influenciam vários desfechos em pesquisas biomédicas3,4,5. Isso é responsável pela variabilidade significativa observada em experimentos e laboratórios de pesquisa4,5, representando uma grande ressalva na pesquisa animal.

Várias abordagens foram implementadas com o objetivo de limitar o impacto dos estressores ambientais e reduzir a reatividade à interação humana. Por exemplo, para limitar o impacto dos estressores ambientais, a padronização das condições de habitação e os sistemas de habitação automatizados6,7 foram implementados em laboratórios. Quanto à interação com os seres humanos, abordagens comumente utilizadas para o manuseio e transporte de animais tinham pouca consideração pelo desconforto e estresse animal. Por exemplo, pegar animais pela cauda ou usar fórceps8 aumenta a ansiedade da linha de base9,10,11, reduz a exploração9,12 e contribui muito para a variabilidade inter-individual dentro e entre os estudos13,14. Como resultado, outras abordagens foram desenvolvidas, como a técnica de manuseio de copos, que é aplicável a ratos e ratos. Nesta abordagem, os animais são “acotosados” para fora de sua gaiola, e mantidos pelos experimentadores com as mãos formando um copo9,10,11. Outra alternativa útil ao manuseio da cauda envolve o uso de um túnel de policarbonato para transferir camundongos9,10,15. Esta abordagem elimina a interação direta entre o mouse e o experimentador. Tanto as abordagens do copo quanto do túnel mostraram eficácia na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade e medo do experimentador que pode ser exagerado por técnicas de manuseio aversivo, como o manuseio da cauda9,10.

Portanto, o aumento das evidências demonstra a utilidade do manejo adequado do camundongo para reduzir a variabilidade entre os indivíduos9,11e melhorar o bem-estar animal10. No entanto, as técnicas mencionadas acima ainda enfrentam limitações. A técnica de manuseio do copo foi implementada com horários que variam de 10 dias (10 sessões ao longo de 2 semanas16) até 15 semanas17, o que é uma quantidade considerável de tempo para funcionários e experimentadores de instalações. Além disso, a eficácia do manuseio do copo varia de acordo com a tensão9 e o manuseio convencional do copo em mãos abertas pode levar a ratos ingênuos ou particularmente cepas saltitantes para saltar da mão9,18. O manuseio do túnel resulta em resultados mais consistentes e geralmente mais rápidos na gentling19. Túneis também são usados como enriquecimento de gaiolas domésticas. Eles ajudam os animais a se habituarem a manusear rapidamente e fornecem os benefícios adicionais do enriquecimento. O manuseio do túnel, no entanto, tem limitações na transferência de animais entre aparelhos. Curiosamente, Hurst e West9, e Henderson et al.20 demonstraram que o uso de manuseio manual suave e breve para transferir animais do túnel para o aparelho não afeta seu fenótipo.

Para fornecer uma alternativa aos métodos existentes, com habitação alcançável em um curto período de tempo, este artigo descreve uma nova técnica que se expande na técnica de manuseio do copo, não necessitando, portanto, de nenhum equipamento específico. Esta abordagem usa marcos para medir o nível de conforto que os ratos têm com o processo de manuseio. Mostra eficácia na diminuição da reatividade e estresse do camundongo (nos níveis comportamental e hormonal), facilita o manuseio rotineiro e contribui para reduzir a variabilidade entre os animais. Detalhes dessa técnica são fornecidos aqui, e sua eficácia na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade, melhorando a interação com experimentadores e limitando a liberação periférica de hormônio do estresse (corticosterona) são demonstradas em dois estudos separados (camundongos masculinos e femininos), em comparação com técnicas de manuseio de túneis (controle positivo) e controle de cauda (controle negativo).

Protocol

Os procedimentos envolvendo os animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com animais do CAMH e realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. NOTA: O método de manuseio aqui descrito pode ser usado em várias cepas de camundongos, incluindo linhas não transgênicas (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) e linhas transgênicas. Também pode ser usado com camundongos jovens ou velhos, observando que camundongos adultos jovens (4-6 semanas de idad…

Representative Results

Dois estudos separados foram realizados com camundongos C57BL/6. O estudo #1 incluiu homens de 6 meses de idade e #2 de estudo incluiu mulheres de 2,5 meses de idade (N=36/estudo) dos Laboratórios Jackson (Cat #000664). Os ratos chegaram à instalação aos 2 meses de idade. Enquanto o Estudo #2 fêmeas foram tratadas e testadas duas semanas após a chegada, o Estudo #1 os machos só foram tratados e testados aos 6 meses de idade (atraso devido à paralisação pandêmica global). Durante esse tempo, um rato de Study #2…

Discussion

Este estudo e o desenvolvimento de métodos baseiam-se na observação de que as técnicas de manuseio em camundongos ainda são negligenciadas pela comunidade científica, e que alguns laboratórios ainda estão relutantes em implementar técnicas de habitação ou manuseio para reduzir o estresse e a reatividade de seus animais antes dos experimentos. Ao mesmo tempo em que representa um compromisso de tempo, o manejo animal proporciona efeitos benéficos aos animais que podem contribuir para o sucesso dos experimentos …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem ao Comitê de Cuidados Com Animais da CAMH por apoiar este trabalho, bem como aos cuidadores de animais do CAMH que forneceram amplo feedback sobre a utilidade do procedimento, motivando a execução dos experimentos descritos e a apresentação do protocolo detalhado para outros usuários. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo CAMH BreakThrough Challenge, concedido ao TP, e por fundos internos da CAMH.

Materials

23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

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Cite This Article
Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

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